风疹病毒分离标准程序

目的

根据中华人民共和国国家标准（GB17009-1997）“风疹诊断标准及处理原则”，对风疹病毒分离作必要的细化和补充，规范风疹病毒分离方法。

适用范围

本操作细则适用于从咽拭子、尿液标本中分离风疹病毒。

操作细则

原理：病毒感染其敏感的靶细胞后，利用宿主细胞的细胞器、酶类及其能量进行病毒核酸复制，引起宿主细胞的形态学改变，出现细胞融合、坏死和脱落。

1、试剂来源

Vero/slam细胞由国家麻疹实验室提供，使用代次不超过15代。

2、操作步骤

2.1维持液的配制 100ml
DMEM 96mL
7.5%碳酸氢钠 1mL
胎牛血清 2mL
青链霉素（10000U/mL) 1mL

2.2细胞制备

在生物安全柜中将生长良好的成片Vero/slam细胞瓶塞拔下，倒去培养液，加4mLEDTA胰酶混合消化液，盖上瓶塞，当肉眼可见细胞层变成淡白色或显微镜下细胞开始圆缩为度，拔去瓶塞，倒去消化液，加入10mL生长液，用吸管沿瓶壁吹打，使细胞充分混匀。

按所需细胞浓度加入营养液分装,10mL/瓶或5mL/瓶，放37℃孵箱内培养。传代后2～3天，在显微镜下观察单层细胞，以确保细胞生长良好，备用。

2.3标本的处理

2.3.1咽拭子标本：低温冻融三次，冻存于-70℃以下，备用。

2.3.2尿液标本：标本采集后24小时内送达试验室，离心处理（4℃,2000rpm,20分钟），弃上清，加入标本保存液1mL，低温冻融三次，冻存于-70℃以下，备用。

2.4标本的接种

2.4.1将标本融化，无菌吸取0.2－0.5mL（根据细胞瓶大小决定）接种到生长良好的单层vero/slam细胞瓶中，接种前倒去细胞培养液，使待检样品均匀地覆盖在细胞上，置35℃孵箱内吸附1~2小时，吸附期间应轻轻摇动2~3次，以避免细胞面干燥。另留1瓶细胞作为阴性对照。每一份标本接种1瓶细胞，并进行正确标记（包括标本编号、接种日期、传代数）。

2.4.2吸附完毕后，为防止标本对细胞产生毒性反应，弃去标本液，加入细胞维持液，每瓶5mL—10mL（大方瓶10mL/瓶，小方瓶5mL/瓶）。放35℃孵箱内培养。

2.5 结果观察

2.5.1每天在显微镜下观察方瓶中的细胞病变（CPE），并记录融合性细胞的产生过程。如果培养基太酸（由橙色变为黄色），需要更换细胞维持液。

2.5.2当出现典型的融合巨细胞病变+++时。将该瓶培养物冻存于-70℃冰箱，备作病毒鉴定之用。

2.5.3如经7天培养未出现细胞病变，则再盲传1代继续观察7天。由于风疹病毒的细胞病变不明显,连续传代2次的分离物应进行病毒鉴定后方可报告结果。

2.5.4细胞病变（CPE）的观察记录格式为：
0～25%的细胞出现病变记录为“+”；
25%～50%的细胞出现病变记录为“++”；
50%～75%的细胞出现病变记录为“+++”；
75%～100%的细胞出现病变记录为“++++”。