病毒分离前样品的预处理方法

病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。

(一)组织器官样品的处理

1、用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂研磨或用组织捣碎机制成匀浆，随后加1-2ml Hank's平衡盐溶液制成组织悬液，再加1-2ml继续研磨，逐渐制成10%-20%的悬液；

2、加入复合抗生素；

3、以800×g离心15min；

4、取上清液用于病毒分离。必要时可用有机溶剂去除杂蛋白和进行浓缩（见下文）。

(二)粪便样品的处理

1、加4g的粪便于16ml Hank's平衡盐容液中制成20%的悬液；

2、于密闭的容器中强烈振荡30min，如果可能则加入玻璃珠；

3、以6000×g低温离心30min，取上清液再次重复离心；

4、用450nm的微孔滤膜过滤；

5、加二倍浓度的复合抗生素，然后直接用于病毒分离或进行必要的浓缩后再行病毒分离。

(三)无菌的体液（腹水、脊髓液、脱纤血液、水泡液等）和鸡胚液样品　

可不做处理，直接用于病毒分离。

注：Hank's平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液的配制。

(四)样品的特殊除菌处理　

样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理：

1、乙醚除菌　对有些病毒（如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、小RNA病毒等）对乙醚有抵抗力，可按冷乙醚：样品=1：1（V:V）加入，悬液充分振荡，置4℃过夜。取用下层水相分离病毒。

2、染料普鲁黄（Proflavin）除菌　由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响，常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。将样品用0.0001mol/L pH9.0的普鲁黄于37℃作用60min，随后用离子交换树脂除去染料，将样品暴露于白光下，即可使其中已经被光致敏的细菌或霉菌灭活。

3、过滤除菌　可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或者200nm孔径的混合纤维素酯微孔滤膜等除菌，但对病毒有损失。

4. 离心除菌　用低温高速离心机以1800r/min（15.24cm）离心20min，可沉淀除去细菌，而病毒（小于100nm）保持在清液中。必要时转移离心管重复离心一次。

(五)待检样品中病毒的浓缩　

对病毒含量很少的病毒样品用一般普通方法不易检测或分离出病毒，必须经过浓缩。常用浓缩方法如下：

1、聚乙二醇（PEG）浓缩法　将分子量6000的PEG逐步加入经一般处理的样品溶液中，使终浓度为8%，置4℃过夜。以3000×g离心15min，用少量含复合抗生素的Hank's平衡盐溶液重悬，必要时用450nm微孔滤器除去真菌孢子。详情可参考一篇经典文献：Concentration and purification of viruses and bacteriophages with polyethylene glycol.

2、硫酸铵浓缩法　将等量饱和硫酸铵溶液缓慢加入经过上述一般处理的样品溶液中，边加边搅拌，置4℃过夜。离心同上。

3、超滤器浓缩法　是一种高效率的浓缩法，特别适合大体积的样品浓缩。

4、超速离心浓缩法 以40000r/min（15.24cm）离心60-120min,绝大多数病毒将沉于管底。用少量Hank's平衡盐溶液悬浮病毒。这种方法回收效率很高，但仅适用于小体积的样品。

(六) 病毒分离样品脂类物质的去除

有些病毒样品（如组织样品）脂类和非病毒蛋白含量很高，必要时在浓缩病毒样品之前可用有机溶剂抽提。常用的有机溶剂有正丁醇、三氯乙烯、氟里昂等。方法是将预冷的等量有机溶剂加入样品中，强烈振荡后，1000×g离心5min，脂类和大量非病毒蛋白将保留在有机相中，病毒保留在水相中。应当注意的是，病毒必须对这些有机溶剂有抗性。