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粉防己生物碱的提取分离与鉴定

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21027
汉防己为防己科千金藤属物Stephania tetrandra S. Mcore的根,是祛风解热镇痛药物,其有效成分为生物碱。主要是汉防己甲素和汉防已乙素。临床上除用作治疗高血压、神经性疼痛、抗阿米巴原虫外,还将粉防已生物碱的碘甲基、或溴甲基化合物作为肌肉松弛剂应用,此外汉防已甲素在动物实验中有抗癌和扩张血管的作用。

目的要求

通过汉防己中几种生物碱的提取分离和鉴定,要求掌握下列知识和技能。

1. 生物碱的一般提取方法。

2. 用低压柱层析分离,纯化单体的方法及薄层层析鉴定

已知生物碱的结构和性质

汉防已根中总生物碱含量为1.5~2.3%,主要为汉防已甲素,含量约1%,汉防已乙素,含量约0.5%;轮环藤酚碱,含量为0.2%;以及其它数种微量生物碱。

1.汉防已甲素(Tetrandrine,汉防已碱,粉防已碱)

无色针晶,不溶于水和石油醚,易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有机溶剂及稀酸水中,可溶于苯,mp 216℃,有双熔点现象,自丙酮中结晶者,150℃左右熔后加热又固化,至213℃复熔。

2.汉防已乙素(Fangchinoline, 又称防已诺林碱,去甲粉防已碱)

溶解行为与汉防已甲素相似,因有一个酚羟基,故极性较汉防已甲素稍高,在苯中的溶解度小于汉防已甲素而在乙醇中又大于汉防已甲素。籍此可以相互分离,用不同溶剂重结昌时,其晶形和溶点不同:

3.轮环藤酚碱(Cylanoline)

为水溶性季铵生物碱,不溶于极性溶剂,氯化物为无色,八面体状结昌,mp 214~6℃,碘化物为无色绢丝状结晶,mp185℃;苦味酸盐为黄色结晶,mp154~6℃。

生物碱的提取分离

1.总生物碱的提取和亲脂性与亲水性生物碱的分离

注一:将汉防已粗粉加适量酸水液,以能将生药粉末润湿为度(约150ml),充分拌匀,放置半小时,均匀而致密地装入渗筒内,用锥形瓶底部或其它平底工具压紧,供渗漉用,流速约1.5ml/分。

注二:净砂必须事前洗净烘干,拌和量最好不要超过120g,以免索氏提取器一次装不下或装得过多。提不尽生物碱。

注三:检查生物碱是否提尽的方法,是取最后一次乙醚提取液约数滴,挥去乙醚,残渣加5%HCl 0.5ml溶解后,加改良碘化铋钾试剂一滴,无沉淀折出或明显浑浊时,表明生物碱已提尽,或基本提尽。反之,应继续提取。

注四:先将提取器内滤纸筒取出。然后将提取玻筒内最后一次乙醚提取液倾出(另器贮存),再将提取玻筒安装好,继续加热,回收烧瓶中乙醚于玻筒中,至烧瓶内的乙醚提取液体积较小时,停止回收,将烧瓶中乙醚提取液倾出。

2.低压柱层析分离汉防已甲素和乙素

低压柱层析在低压下(0.5~3kg/cm2,一般0.3~1.2 kg/cm2)采用颗粒直径介于经典柱层析(100~200μm)和HPLC(~37μm)之间的薄层层析用硅胶(或氧化铝)H或G(50~75μm)作为填充剂的一种柱层析柱,其基本原理与HPLC相同,分离效果也介于经典柱与HPLC之间,用减压干法装柱,铺层紧密均匀,层析带分布集中整齐,同时薄层层析的最佳分离溶剂系统可以直接用于低压柱层析,它是一种分离效果较好,设备简单,操作方便,快速的方法。适宜和于天然产物的常量制备性分离。

(1)装柱 减压干法装法,层析柱规格:柱长30cm,内径2cm,共装硅胶约30g(高约22cm)。

(2)拌样加样 取汉防已碱约150mg,加少量丙酮热溶(刚溶为度)用滴管加到1.5g硅胶上,仔细拌匀,水浴上蒸干,碾细,通过一个长颈漏斗小心加在柱顶,轻轻垂直顿击,待样品表面平整不拌动时,上面再盖约1~2cm高的空白硅胶,再加盖一园形滤纸片,压紧。

(3)洗脱 先检查从空压机至层析柱各阀门管道是否正常,关紧各个阀门,开动空压机至额定压力(5.8kg/cm2)待用。用滴管顺层析柱柱壁仔细加入少量洗脱剂(环已烷-惭酸乙酯-二乙胺/6:2:0.8),当液面达到一定高度时,再一次加入其余洗脱剂(共约250ml),迅速在柱顶上装上玻璃标口塞接头,用铁夹压紧(防加压时接头冲开),小心开启空压机阀门,再开针形阀和空气过滤减压器,(注意:压力过大。玻璃柱会炸,一般2kg是安全的,必要时可戴防护面罩)调动所需压力,0.6~1.2kg/cm2,约40分钟后流出,控制流速1ml/分,每10分钟左右一管,收12~15份,洗脱全过程约3小时。

(4)检查 各流份分别移入小玻璃蒸发器中,于水浴上浓缩,分别通过TLC检查,吸附剂:硅胶G,展开剂:环已烷-乙酸乙酯-二乙胺/6:3:1,改良碘化铋钾试剂喷雾显色,以汉防已甲素、乙素为标准品对照,合并相同组分,分别获得甲、乙素粗品,用丙酮重结晶,测定mp。

鉴定方法

1.衍生物制备

取汉防已甲素0.2g,溶于2ml(丙酮中,滴加苦味酸饱和水溶液至不再折出黄色沉淀为止,抽滤收集沉淀,顺次以少量水乙醚洗涤,乙醇重结晶,得汉防已甲素苦味酸盐,mp 235~242℃(dc)。

2.有机胺碱的TLC

吸附剂:青岛海洋化工厂薄层层析硅胶G,用0.3%CMC-Na水液制板,110℃活化1小时。

样品:分出的汉防已甲素①、乙素②、总碱③

展开剂:环己烷- EtoAc-NHEt2(6:2:1)

显色剂:改良碘化铋钾试剂(展开后用电吹风吹干再喷显色剂,以免二乙胺干扰)

现象:甲素显色后呈淡棕色,2小时左右就褪色,而乙素呈棕色,久置不褪色,可帮助其辨认。

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