ELISA实验操作流程及注意事项

一、包被抗原

1. 用 50mM 的碳酸盐包被缓冲液 （pH 9.6） 溶解抗原， 使抗原浓度为 10-20 μg/ml，加 100 μ l/孔到 96 孔酶标板，4℃放置过夜。

2. 第二天弃去包被液后，用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μ l 1％ BSA 37℃封闭 1 小时。

3. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ℃ 孵育 2 小时。

4. PBST 洗涤 5 次后， 加入100μ l 稀释后的 HRP 标记的二抗， 37℃孵育 1 小时。

5. PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20 min 后，酶标仪上读取 A 405 吸收值。

二、包被细胞

1. 在 96 孔培养板上接种细胞数为 1 x 104 cells/well，37℃过夜培养。

2. 第二天用 PBS 洗涤培养板 2-3 次。

3. 加入 125 μ l/well10% Formalin（1:10 稀释），室温下固定 15 min。

4. 用 ddH2O 洗涤培养板 3 次，并晾干，储藏在 2- 8 ℃ 备用。

5. 用 PBST 洗涤 3 次，每孔加入 150 μl 1％ BSA 37 ℃ 封闭 1 小时。

6. PBST 洗涤 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 ℃ 孵育 2 小时。

7. PBST 洗涤 5 次后， 加入100 μl 稀释后的 HRP 标记的二抗，37 ℃ 孵育 1 小时。

8. PBST 洗涤 5 次后，显色剂显色 20 min 后，酶标仪上读取 A 405 吸收值。

① 50mM 的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液，4℃，保存，Na2CO3 0.15 克，NaHCO3 0.293 克,蒸馏水稀释至 100 ml。

② ABTS 作为底物进行显色反应(10ml)：0.2M Na2HPO4 2.4ml ；0.1M 柠檬酸 2.6ml ；ddH2O 5ml ；ABTS 5mg；H2O2(30%) 4 ul （用前加入）

注 意：

1. 一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。

2. 不同的显色系统对应不同的光吸收值