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SDS-PAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定

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一、实验目的与原理

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现,如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS),大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合,即每克蛋白质结合1.4g的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,因而消除了蛋白质原有的电荷差别,使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量,而与蛋白质所带的电荷无关,在一定条件下,蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。

本实验的目的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定,通过实验,学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。

二、仪器与试剂

1、材料:

硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层析的样品,Sephadex G-100柱层析的样品。

2、试剂:

(1)丙稀酰胺(Acr母液):30%Acr (Acr/Bis)

(2)10%的SDS溶液

(3)10%的过硫酸铵溶液

(4)四甲基乙二胺(TEMED)

(5)分离胶缓冲液:1.5M Tris,PH8.8

(6)浓缩胶缓冲液:1.0M Tris,PH6.8

(7)电极缓冲液:10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS,加水溶解定容至1000ml,pH8.3

(8)样品缓冲液:0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油,巯基乙醇及溴酚兰

(9)染色液:0.15%考马斯亮蓝R250,溶于脱色液

(10)脱色液:50%的甲醇,7%的冰醋酸的水溶液

(11)标准分子量蛋白。

3、仪器设备:

电泳仪、垂直电泳槽等。

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