如何使PC12细胞贴壁更牢

丁香园ivy_mayan的问题：

在做PC12的H2O2损伤模型时，由于细胞经过H2O2的冲击，大多活性不好了，所以贴壁性变差，结果在测MTT时由于要去掉上清液，细胞会被一同吸走，这样所测吸光值就不准了，请问大家，怎么可以使PC12贴壁更牢（即使经过损伤冲击）？

丁香园george的观点：

1.细胞培养板的选择：一定要用进口的培养板，国产的大多贴不好。

2.尽量使细胞处于良好的状态，包括培养液要新鲜配制备，注意PH值，提高牛血清的浓度。

丁香园midas的观点：

1.用PLL或鼠尾胶包被扳子！

2.H2O2浓度越大，作用的时间应该越短。

3.MTT时，不必要完全吸去上清液（当然每个孔吸出的量应该一样多），尽量不要洗掉细胞。

丁香园drcici的观点：

细胞的贴附状态涉及很多方面，细胞的类型，细胞本身的状态，培养条件以及培养板等因素都可以影响细胞的贴附。

除了以上高手的经验外，我想还要注意PC12的密度，一般良好状态的PC12生长迅速，可以在2~3天就可以长满一个中皿，如果你用96孔板的话，长满的时间应该更短。但是长得过满的细胞状态并不好，容易脱落，不知你的PC12是以何种密度接种的，什么时间加双氧水？最好是在PC12长至70-80%时加双氧水。

还有加入的双氧水的温度，也要与培养温度相同，去除双氧水后，要用培养液把细胞洗2-3遍。

丁香园ivy_mayan的问题：

具体我是这样操作的：96孔板

以2x10的五次方密度接种细胞，24小时后加入不同浓度的h2o2（50-500UM）, 作用不同时间后(0-8h)加入MTT,孵育4h后去上清，加入DMSO溶解结晶,测490nm下的吸光值。

我有以下疑问：

1）板我已经过poly-l-lys处理过，但是细胞贴壁还是不好,如何解决？

2)加入MTT前是否要把培养液去掉, 并用PBS洗两遍以彻底去除H2O2及血清的影响，只是这样一来细胞会丢失很多,该如何解决？

丁香园midas的观点：

1.增加PLL的浓度，50－100ug/mg

2.没有必要把培养液去掉，并用PBS洗！H2O2及血清对MTT的影响好像 还没有见到相关报道。

丁香园liandchu的问题：

我培养的细胞是pc12细胞,这种细胞不好贴壁,我用多聚赖氨酸包被,但我不知道多大分子量多聚赖氨酸及浓度去包被效果好?,

丁香园luopeng的观点：

用赖氨酸包被培养板和培养瓶时，应该选用多聚左旋赖氨酸(分子量为15-30万) ，我们用的是sigma P7890,效果还不错。

丁香园sweet的问题：

我打算养pc-12 ，听说这个细胞很难伺候，请教培养方法。何种培养基好?NGF的种类有讲究吗？

丁香园lrmoon的观点：

PC12细胞我养过，谈一谈体会，希望对您有帮助。

总体上PC12细胞不难养，不要有畏惧思想。

1.Medium：DMEM加2.5%FBS, 15%horse serum(都用Gibco的)

2.复苏后首次分皿时经消化后尽量用tip头柔和吹打15次，使成单细胞。

3.诱导可在经poly-l-lysine coating的24孔板中进行，细胞的种植密度不可太高，1×10E5即可。一般情况下经NGF50ng/ml一周就可见很明显的诱导特征（突起伸长，胞体变小，增殖减缓）

4.包被非常重要。PLL要质量好，不要多次回收使用，一般使用两次就丢弃。包被过夜后要彻底用灭菌ddH2O洗3遍。

5.实验尽量使用同一批号的试剂，以免细胞的表型发生变化影响实验结果。

6.NGF的质量也很关键，建议用sigma的。