慢病毒包装步骤

以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。

1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。

2、取1.5ml灭菌EP管，取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。

3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min

4、用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。

5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。

6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育过夜。

7、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM（含丙酮酸钠和非必须氨基酸）。

8、转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min，去除沉淀。

9、病毒上清-80°C贮存。

包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

注意事项：

1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒的滴度。病毒的滴度可以通过转染Hela细胞，然后使用抗体筛选稳定的细胞转染株，进行计数和数值统计。

2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。