慢病毒包装简要步骤:
以六孔板中的1孔为例,每个样品需要1×106个293T细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管,加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。轻柔混匀,室温孵育5min。
2、取1.5ml灭菌EP管,取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清培养基中。轻柔混匀,室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min
4、用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔,加入1ml含血清的生长培养基,再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293T细胞(1×106个细胞/ml)加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除,代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min,去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
注意事项
1.在慢病毒感染细胞前,为检测病毒上清培养液内病毒的活性,并确定病毒与转染细胞之间的比率,需要确定病毒的滴度。病毒的滴度可以通过转染Hela细胞,然后使用抗体筛选稳定的细胞转染株,进行计数和数值统计。
2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合,只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞,因此,病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。.