慢病毒包装简要步骤及注意事项

慢病毒包装简要步骤

以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。

1. 取1.5 ml灭菌EP管，加入1.5 μg包装混合质粒和0.5 μg表达质粒以及250 μl的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5 min。

2. 取1.5 ml灭菌EP管，取9 μl 脂质体2000 l溶于250 μl无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5 min。

3. 将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20 min

4. 用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。

5. 在六孔板中每孔，加入1 ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。

6. 将1 ml重悬的293T细胞(1×106个细胞/ml)加入到平板中。37 ℃ CO2孵箱中孵育过夜。

7. 移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)。

7. 转染后48-72 h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20 min，去除沉淀。

8. 病毒上清-80 ℃贮存。

包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

注意事项

1. 在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒的滴度。病毒的滴度可以通过转染Hela细胞，然后使用抗体筛选稳定的细胞转染株，进行计数和数值统计。

2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。