western操作步骤

1.制胶及上样：

(1)配制12%SDS-PAGE 分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。

(2)待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。待胶完全聚合。

(3)将凝胶固定于电泳装置上，上、下槽加入电泳缓冲液。

(4)小心拔去加样梳，使加样孔竖直，以电泳缓冲液冲洗加样孔数次。

(5)分别取50µg蛋白量的细胞总蛋白样品及蛋白质分子 量Marker，按4：1体积比加入5´样品缓冲液，以1´样品缓冲液?配平上样体积(总体积20µ1)后，于沸水浴中煮3min使蛋白变性。

(6)将处理好的样品按照预定的顺序加入分离胶的上样孔中。

2.电泳

(1)接通凝胶电泳仪 的电源，初始电压70V。(约30分钟)

(2)溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。(约60分钟)

3.转膜

(1)从玻璃板中取出凝胶，将其浸泡于转移缓冲液中。

(2)取与胶同样大小的硝酸纤维素膜，以95%乙醇浸泡5秒钟后浸泡于转移缓冲液5分钟以上待用。

(3)按顺序在转移夹内放置预先经转移缓冲液浸泡的海绵、三层滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、三层滤纸、海绵，保证每层之间没有气泡。

(4)将转移夹放入转移槽，膜在正极、胶在负极，接冷却循环水，90V稳压转移2小时。

4.染色

(1)将硝酸纤维素浸入丽春红使用液中，振摇染色5-10min。

(2)蛋白质条带出现后，用去离子水 洗去硝酸纤维膜上的丽春红底色。

(3)按照蛋白质分子量Marker指示的位置剪下目的条带所在的硝酸纤维素膜。

5.封闭

把硝酸纤维素膜浸入5%脱脂奶粉，室温摇动2小时。

6.洗膜与杂交

(1)以T-TBS洗膜，10分钟´ 3次。

(2)第一抗体封闭： SPARC单抗以T-TBS 1：200稀释，按0.1ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，4℃振摇过夜。

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(3)以T-TBS洗膜，10分钟´ 3次。

(4)第二抗体封闭：辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体(1：4000)，按0.1 ml/cm2加入封有硝酸纤维素膜的杂交袋中，去除所有气泡，室温下振摇60分钟。

(5)以T-TBS洗膜，10分钟´ 3次。

7.化学发光与曝光

(1)将化学发光试剂盒中的两种试剂各取0.5ml，按1：1的比例混合，在暗室中与硝酸纤维素膜摇动孵育1分钟。

(2)用滤纸沾干膜上的液体，用保鲜膜包好，用感光胶片在压片盒中曝光约1分钟。

(3)曝光后的感光胶片在显影液中显影约30秒钟，定影液中定影1分钟，用水冲洗后晾干。

(4)根据曝光情况调整曝光时间，重复压片、显影及定影，选择满意的胶片。

(5)重复实验三次