凝胶层析的概念及其原理

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凝胶层析定义

凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体 ，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。

凝胶层析原理

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单个凝胶珠本身象个"筛子"。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子 不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长!凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。

凝胶层析分类

葡聚糖凝胶是指由天然高分子 -葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech 生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex 和Sephacryl。

葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex 系列，它是葡聚糖与3-氯-1，2环氧丙烷(交联剂)相互交联而成，交联度由2环氧丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型号是G-10 ~ G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是mL / g 干胶)乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干胶。Sephadex 的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex 的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex 中排阻极限最大的G-200为8×10。

Sephadex 在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex 稳定工作的pH 一般为为2~10。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex 与强酸和氧化剂接触。Sephadex 在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100 °C 下40 min 对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。Sephadex 由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团(尤其是碱性蛋白)发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex 进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex 与蛋白发生吸附，但应注意如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。

Sephadex 有各种颗粒大小(一般有粗、中、细、超细)可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差;细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex 的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。另外，Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH 型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。

Sephacryl 是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺(N，N'-methylenebisacrylamide)交联而成。是一种比较新型的葡聚糖凝胶。Sephacryl 的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex 的范围。所以它不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒 、甚至较大的病毒颗粒。 Sephacryl 与Sephadex 相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高：Sephacryl 在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液，耐高温，Sephacryl 稳定工作的pH 一般为3~11。另外Sephacryl 的机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高，所以Sephacryl 相比Sephadex 可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。

凝胶的选择

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凝胶

根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子 物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质(1000-5000)的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。

根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。

凝胶柱的制备

凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。

凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。

加样和洗脱

凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%-10%。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。

凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存

一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。

如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。

凝胶层析的应用

⑴ 脱盐：高分子(如蛋白质、核酸、多糖等)溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25%-30%，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。

⑵ 用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。

⑶ 测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。

⑷ 高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液