小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养

养BMDC有好几个月了，看了2、3篇文献就开搞，发现论坛里还是有一些战友养这个。就想开个专题讨论贴，请新手老手都上来谈谈经验或者问些问题。集思广益，大家相互促进下。

我在论坛里看到因为有战友养DC看百把篇文献的，感到佩服又奇怪，就BMDC的培养我目前只知道有个经典版本和改良版本。

我用的是改良版本，参考文献改天附上（可能养这个的战友大多看过了）。

1. 取小鼠股骨胫骨，小鼠要年轻！（6W-8W，以前用只一年左右的养出来外形也张牙舞爪，但流式检测没有CD11c表达，很奇怪啊；性别方面公母不限，经典版本说公的好，公的壮实，骨头大）。

2. 冲骨髓细胞，我冲出来的骨髓细胞永远没有文献上说的那样多，但不影响大局，我一次用两只，怕出意外少了细胞，论坛里有战友说不要混一起，我不知道具体原因，盼赐教。

3. 细胞计数，不去红细胞！（不知是好是坏，文献说去红细胞会把一些祖细胞也去掉了）记数，计数只记白细胞（形态学区分，红细胞无核较小，目前我的眼睛目前还在为此积累经验），2×10e6（似乎太低，这套方案作者是一皿养到第12天的，所以我个人觉得看你在哪天收细胞做下游实验，如果只养到第6天或者第8天，多点应该也行吧？）白细胞种100 mm细菌培养皿（注意是细菌培养皿，说悬浮细胞还是用细菌皿好，还说抑制细胞贴壁，让更多祖细胞向树突细胞分化而不是巨噬细胞），这一天记为第0天。

4. 第3天加等体积（10 ml）BMDC培养基

配方：每50 ml含：1640基础培养基45 ml，5 ml灭活胎牛血清，50 ul 100×的β-巯基乙醇（一直不知道它的作用，请高手跳出来作答谢谢啊），500 ul 100×的谷氨酸盐（谷氨酰胺？我现在用Gibco的Glutamax，说不会降解产生氨），1 ug rmGM-CSF（Chemicon和PPT的都用过，现在用PPT，好像还行）。

5. 第6天，第8天半量换液，离心设置为300 g，5min（不知道够不够，肯定有损失）。

6. 第10天300 g，5min收集悬浮细胞转到细胞培养皿（巨噬细胞多贴点壁），同时培养基成分里rmGM-CSF含量至少减半（好像说怕继续分化成非树突吧，文献看了有一段时间记得不那么清楚了惭愧啊，其实文献仅供参考，也不一定对，关键还是自己的实践）。

7. 第11天加LPS刺激其成熟，普遍认为（也可能是我自己认为），第6天或第8天收不成熟DC会比较多，看实验需要，建议想要不成熟DC的朋友请在这两天收网）。

我一般做到第5步就上流式，也就是6到8天的BMDC, CD11c表达波动在50－80％，偶尔做CD86，成熟标志吧？15％左右。具体流式结果和光镜形态照片过几天（或几周）发上来大家一起探讨。MHC2我没有做（技术员说实验室流式机器做APC的有关部件有故障，我的MHC2抗体正好带APC）。还发现用PE标记和FITC标记的CD11c流式抗体检测CD11c表达发现阳性细胞数（还是表达量）相差1倍？（同一批细胞分两管，分开操作，抗体剂量不同，都过量了，都洗了两遍，一个公司的抗体，25％和50％）。

最近有个造血生理的老师说这个方案她们是用来养单核细胞和粒细胞（我已经不确定了，得再问问她）的，对我打击很大。说聚集体包括粒细胞、巨噬细胞（还有什么不记得了，得再问问她）。她建议我流式检测加个阴性指标，我觉得很有道理。我是不是检测的指标太少了？发现国外的也有少有多，但没有我这么少的。

我养出来的BMDC目前还从未做过功能实验（MLR和CTL）。会陆续搞起，到时候上来求助大家。

总结：讲得比较乱请战友们谅解，我从未在论坛发过如此长篇大论。请支持我，尤其是搞这个的，请顶一顶。抛砖引玉。希望本贴能成为BMDC培养的旗舰贴，不为别的，为搞这一块或者用到这一实验技术的菜鸟们（rookie）早日找到组织，为二年级生（sophomore，像我这种）继续提高，恭候有丰富经验的大牛们（superstar）的大驾，为这一技术传道授业解惑。谢谢啊！

丁香园站友cj_1968认为：

1. 培养100％纯的DC几乎是不可能，一般达到85％就不错了，在收集细胞是只要吹打不要太猛，巨噬细胞一般是不会悬浮起来的。

2. 我有时也几只小鼠的骨髓细胞混养，但只要是同系（如：都是C57）的，问题不大。

3. 如果取自不同系的小鼠如Balb/c和C57的骨髓细胞混养就不可避免地产生混合淋巴细胞培养。

丁香园站友dongwp认为：

骨髓细胞中有淋巴细胞，两个个体的细胞混合会产生“混合淋巴细胞培养”反应，导致淋巴细胞大量增殖