免疫组化非特异性染色太深怎么办？

本人从事免疫组化实验做了好多年了，刚开始做这方面实验，出现了不少问题，最让人头疼的就是非特异性背景染色问题。经过多年的摸索和亲身实验，摸索出问题的症结所在，针对免疫组化中存在最常见的非特异性背景染色问题，给予一些本人的见解和经验总结，希望对做科研的工作者们一些帮助和指导，也希望各位专业人士能给予批评指正。当然这些经验总结和问题的，离不开丁香园、小木虫、中华病理网以及舜百公司专业病理人员的指导和帮助，是这些网站以及专业公司的帮助下，让我受益颇多。

免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的组织化学技术。 组织的非特异性染色的机理很复杂,所以控制非特异性背景染色也不容易, 现简单介绍一下：

一、非特异性染色的识别：

1. 静电吸附

抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合。

在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清封闭组织上的带电荷基团，从而除去与第一抗体的非特异性结合。此法为最有效的方法。如果还不可以的话可能蛋白质封闭不够或所用血清溶血。

2. 内源性过氧化物酶

红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。

石蜡切片 3%双氧水-甲醇溶液处理切片；

3. 洗涤不彻底

保证各步骤的PBS或TBS冲洗的时间和量，方法要得当，最好可以把切片放在装满洗液的染色盒内浸泡一段时间以确保充分清洗。有一些人鉴于实验经费紧张，那吸管滴加标本上冲洗，这样很难保证冲洗的干净与否。这实际是千里之堤，溃于蚁穴。

4. DAB显色反应时间过长

最好是在显微镜下时时观察一避免显色回见过长而引起的非特异性染色背景

5. 一抗稀释液
可以在一抗稀释液内适当添加1%BSA或合适浓度的二抗来源的血清。

以上是本人将亲身实验经验，加上网上资料以及舜百公司帮助而总结出的一些非特异性染色原因分析和控制的，希望能给各位提供一些帮助和指导！