感受态细胞的制备及溶液配制

1. 挑取适当菌株的 E.coli 单菌落接种于 2mlSOB 培养液中，37℃摇床过夜。

2. 取 0.5-1ml 过夜培养的菌液 转种到 50ml SOB 中，18℃剧烈震荡，直到 A600达到 0.6。

3. 将培养物转移到 50ml 离心管中，4℃ 4,000rpm/min离心 10min。同时在冰浴 上配置 TB 溶液。

4. 弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。

5. 取 1ml 刚配的 TB 溶液打散菌体沉淀，再加入 15mlTB（1/3 体积的起始培养 液） ，冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min离心 10min。

6. 弃上清，沉淀重悬于 4mlTB（1/12.5 体积的起始培养液） ，冰浴10min。

7. 加入 280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴 10min。

8. 将菌液分装于 EP 管中，- 80℃或液氮冻存。

9. 取两管感受态细胞分别加入 1μl 无菌 ddH2O（阴性对照）和 1μl 纯质粒（阳性 对照）进行转化（见后） ，以检测感受态的质量阴。性对照平板上应该无菌落 生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。

0.1M K -Pipes(pH=6.7)的配制：

称取 3.02g Pipes粉末溶于 80mldd H2O 中，此时粉末不能完全溶解，用 10N KOH 或 KOH 固体调节 PH 值，只有当 PH 接近 6.7 时粉末才能完全溶解，此时 当小心少量地加入 KOH 直至达到所需 PH 。