溶液配制法

动物细胞工程的主要操作对象是离体条件下动物有机体的各部分组织、器官或细胞，这些用来进行离体培养的组织或器官称为外植体；动物胚胎工程的主要操作对象是配子和胚胎。要满足操作对象在离体条件下正常生存和生长发育，就必须为其提供适宜生长发育的良好营养条件，即培养液条件。动物的组织、细胞或配子、胚胎在营养代谢、生长发育等多方面相比较，存在着诸多差异，营养需求也不尽相同。所以在进行动物组织、细胞及配子、胚胎的离体操作或培养时，需要配制不同的操作液或培养液。因此，了解培养液的组成与掌握其配制方法是细胞与胚胎工程研究与实验的一项基本任务。由于动物细胞与胚胎工程操作对象的特点，常用操作液及培养液一般配制为液体状态。操作液及培养液中一些成分在溶液中不稳定，配制时一般先将液体的最基本成分配成基础液，使用前将这些成分作为添加成分加入基础液最终配制成操作液及培养液，不同的培养液及不同的实验室在添加这些成分时采用的方式有所不同。

动物细胞与胚胎工程的操作是基于无菌条件下进行的，需要建立一套满足无菌操作技术和无菌培养的环境，配制无菌的液体为最基本的条件。而液体在制备过程中往往带有各种杂菌，配制成液体后应立即灭菌，或在24小时内完成灭菌工序。由于动物细胞与胚胎工程操作液和培养液组成成分中常含有遇热易分解的物质，所以多采用过滤方法除去操作液和培养液中的细菌，并在过滤除菌时完成分装。为了检验配制的液体是否仍有细菌污染，配制成的液体应间隔一定时间进行检查，如颜色是否变化、是否发生浑浊以及是否有菌落出现等，如有必要可进行培养检查。

一、液体配制的准备

1．仪器设备的检查调试

液体配制涉及的仪器设备，如高压蒸汽灭菌器、鼓风干燥箱、精密电子天平、超净工作台等，在使用前按照说明书，在工作状态下进行检查、调试。

2．物品洗涤及消毒灭菌

按照第二部分介绍的清洗程序，将与液体及其成分接触的物品清洗干净、蒸馏水漂洗后，60 ℃烘干。用于药品试剂溶解、混合、定容的器皿即可使用。用于液体无菌处理和分装的器皿及物品进行包装，耐高温的器皿及物品采用恒温鼓风干燥箱进行干热灭菌；不耐高温的物品采用高压蒸汽灭菌器进行湿热灭菌，湿热灭菌的物品应再烘干。

二、常用操作液及培养液的配制

以实验指导实验项目中常用的操作液和培养液为例，介绍液体配制方法。

1．无Ca²⁺、无Mg²⁺磷酸盐缓冲液[PBS(-)]

无Ca²⁺、无Mg²⁺磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)常用作细胞培养的操作液。配制方法为，称量NaCl 10.0 g，KCl 0.25 g，Na₂HPO_4·12H₂O 1.44 g，KH₂PO₄ 0.25 g，四蒸水500 mL，烧杯内磁力搅拌充分溶解，1000 mL容量瓶定容，分装，15磅高压蒸汽灭菌30 min，4 ℃冰箱保存。

2．0.25％胰蛋白酶细胞消化液

胰蛋白酶0.25 g，EDTA0.04 g，PBS(-)液100 mL，烧杯内磁力搅拌充分溶解，0.22 um滤膜正压过滤，4mL/瓶分装，-20 ℃冰箱保存。

3．DMEM细胞培养液

DMEM液(Dulbicco's minimal essential medium)主要用于细胞培养。称量高糖DMEM粉13.4 g，NaHCO₃ 3.7 g，分别加四蒸水300 mL，磁力搅拌充分溶解，再将NaHCO₃溶液缓慢加入DMEM液中，1000 mL容量瓶定容，调pH7.2，加血清 110 mL，80单位/mL青霉素，100单位/mL链霉素，0.22um滤膜正压过滤，分装，4 ℃冰箱保存。

4．改良杜氏磷酸盐缓冲液（mPBS）

改良杜氏磷酸盐缓冲液（modified phoaphate buffer solution, mPBS）常用作胚胎回收的操作液（冲卵液）。

配制过程：

（1）分别制备A、B、C三种溶液，三蒸水量加至最终量的80%，置冰箱冷藏室中冷却后依次混合，可防止沉淀，然后用容量瓶定容至1000mL。为了指示pH值，可加入酚红，但它不是PBS的成分，一般加1.0%(g·mL^-1)溶液1.0mL·L^-1。

（2）用0.2 mol·L^-1NaOH或0.2 mol·L^-1HCl调整PH至7.1～7.2(如蒸馏水新鲜，称量准确无误，配成后PH即为7.1～7.2，不必调整。实际应用时，若pH不准，也可能是蒸馏水、试剂或称量准确性问题)。使渗透压稳定在约290毫摩尔渗透压浓度(mOsm)。

（3）如试剂含结晶水量与配方不符，应按分子量换算。对易吸潮的试剂，要在配制前烘烤干燥。烘干温度要查阅化学手册，以不使试剂分解或损失分子中的结晶水为原则。

（4）用G6滤器抽滤除菌，或用针头滤器安装滤膜后正压过滤除菌。

（5）在制备过程中，特别是过滤、分装时要严格遵守无菌操作规程。配制好的液体分装密封后，标明配制日期。4 ℃冰箱中可保存1～4个月。不可在冰箱冷冻室或低温冰箱中保存，否则会有盐类结晶析出。

（6）临用前按需要量加入牛血清白蛋白或灭能胎犊血清、新生犊牛血清。一般在冲卵液中加入血清的浓度为2％～5%。为了使用方便，可在过滤前加入血清，然后再过滤分装。血清灭能可除去血清中的毒胚因子，灭能方法是把血清在56 ℃下维持3O分钟。

5．CZB液

CZB液为Chatot CL,Ziomek CA和Bavister BD于1989年发表的专为克服小鼠胚胎体外培养中2-细胞阻滞的培养液，并以三人的名字缩写简称为CZB液。其基本组成成分见表4-2。其特点是在早期卵裂阶段不使用可能导致胚胎发育延迟和发育阻滞的葡萄糖，而使用谷氨酰胺克服小鼠胚胎的2-细胞阻滞。但早期胚胎发育到后期，需要在含5.56 mM浓度葡萄糖的CZB液中培养48 小时，可很好地支持桑椹胚发育到囊胚。近年来，CZB液及其改良液体常被用于小鼠胚胎体外操作和培养的液体。

6．KSOM液

KSOM液最早为Lawitts和Biggers(1991,1992)发表的SOM液(Simplex Optimized Medium)，可支持受精卵克服2-细胞阻滞。后来，SOM液的NaCl和KCl浓度被提高后(Lawitts和Biggers 1991，Erbach et al 1994)，新的液体被称为KSOM。KSOM液培养小鼠胚胎时，有较高的细胞分裂率和较高的囊胚发育率。KSOM液的基本组成成分见表4-3。

CZB液及KSOM液的配制方法：用四蒸水或超纯水溶解NaCl、KCl、KH₂PO₄、NaHCO₃、乳酸钠等基本成分及丙酮酸钠、EDTA、青霉素、链霉素等添加成分，共同组成A液；CaCl₂和MgSO₄.7H₂O分别溶解，为B、C液。将三种液体在4 ℃冰箱降温后混合，以防止沉淀，混合后用蒸馏水定容。之后加入酚红(1%,mL·mL^-1，加入量1000mL·L^-1)，观察颜色并用精密试纸和仪器测定pH值，并用0.2 mol·L^-1 HCl或0.2 mol·L^-1 NaOH调pH到7.3±0.1。用滤器进行细菌过滤，分装备用。谷氨酰胺（终浓度一般为1 mmol·L^-1，母液1%，每mL加10 mL）、葡萄糖则先配成高浓度的母液，临用时将母液加入培养液而达到最终浓度；血清或BSA则分成小包装，在临用时加入培养液，血清终浓度一般为10～20%(V/V)，BSA终浓度一般为4000 mg·L^-1。使用时按所需浓度加入血清、BSA和谷氨酰胺后，用0.22 um的滤膜再次进行细菌过滤。另外需要注意的是，将BSA加入培养液时勿搅拌或剧烈晃动，以免产生大量泡沫，应将所需量BSA撒在液体表面，待其自溶或轻轻晃动溶解。