启动子片断插入到了pgl3basic载体时未出现荧光的原因

【求助】启动子片断插入到了pgl3basic载体中，为什么没有检测到荧光？

参与者：smile1688

我把一个基因的启动子片断插入到了pgl3basic载体中，但是却没有测到荧光。阳性对照，即Pgl3 control检测到荧光。

推测：

1、启动子片断错误。

1000bp，已测序验证，在ATG前40bp，推测离转录起始位点还有200bp以上。

2、细胞的转录效率太低。

但是Pgl3 control和TK值都在10万以上。

3、细胞内的因子没有启动启动子活性。

启动子和转染的细胞不是同一个物种，但是大家好像都这样做的，并没有什么问题。

请各位做过这个实验的提点意见，现在正在困惑中。先行告谢。

参与者：yangea

我们实验室一直在从事此方面的研究工作，所以看到pGL3-basic感到格外亲切，呵呵。可能原因分析：

1、结合已有的文献分析所选定的上游调控序列是否为该基因的核心启动子区，是否包含基因转录所需的元件；

2、细胞转染效率低这方面的影响可能并不能完全排除。因为pGL3-control是含有SV40的强启动子和增强子的，而构建质粒luciferase上游转录起始效率不好说，也就是说在转染效率不高的情况下可能能检测到pGL3-control的发光，却检测不到构建质粒的发光；

3、启动子和转染的细胞并不要求必须是同一物种，我们做的也有人和小鼠的；

4、排除细胞转染过程中的影响。

多多交流！

非常感谢，正在用实验进一步验证

参与者：smile1688

这个星期换了IB细胞做了一下，发现我构建的两个载体发出的荧光的数值在800左右，空白荧光100左右，pgl control 得出的值在10万左右。

载体的浓度是基本一致的。

请问各位，800左右的值相对于pcl control 只有1/100 正常吗？

参与者：zhao22840718

to smile1688：

启动子上下游你怎么选的? 转录起始位点下游多少碱基?

参与者：smile1688

我是根据人的转录起始位点推测我这个物种上的转录起始位置，我插入的片断应该包括转录起始位点下游150bp，上游大概1000bp左右了。

但是这也是我一直怀疑的一个推测，我正在用实验证明。

谢谢zhao22840718。

参与者：zhao22840718

我感觉这下游的150bp挺重要的，不要有ATG.

个人看法，如果ATG和Luc ORF不同，可能造成移码.导致没有荧光信号.

参与者：smile1688

是，赞同你的看法.

我这个片断现在是在ATG前面80bp，离推测的转录起始位点有150多个bp.

现在就是怀疑是不是这ATG前80bp也是很重要的.

已经开始克隆一个片断含有AT没有包括G，且后面加的序列肯定不能是G.

参与者：kgbond

最近看到一篇文章，把外显子一都加进去了，其中的ATG是否有影响，如果两个ATG的阅读框相同，是否能顺利产生荧光？

参与者：smile1688

这篇文章解释了没有，为什么要加这个外显子。

这样你还需要考虑到移码的问题，还要保证你插入的ATG到萤火虫荧光素酶的ATG前面么有终止密码，这样才可以正确翻译一光素酶。

参与者：smile1688

yangea 建议

找个在转录水平上调你目的基因表达的阳性药试试，看作用于你构建的载体瞬转的细胞后，细胞的荧光值是否上调，验证一下。

参与者：tokyy

LZ的插入片段包括了推测转录启始位点前的Promoter和之后的部分5'UTR。

就已经报道的资料来看，5'UTR对转录的效率是有影响的。特别是在上游启动子没有明显的对基因转录有重要意义的TATA盒（真核生物）时候，5'UTR对转录起到了明显的促进作用。而且根据文献报道，在启动上缺乏TATA盒时，很多情况下基因会有不同转录的启始位点……这样一来情况就复杂了。

将“外显子一”和报告基因融合，则不需要考虑上诉5'UTR对下游报告基因的影响。因为基本上“外显子一”片段较短，融合后对报告基因的构象改变得不大，融合后的报告基因（“外显子一”+报告基因）仍具有先前的活性。看过很多老外的都是这样做的。有的还采用“启动子+Exon01+Intron01+Exon02+报告基因”的表达方式。