流式细胞凋亡检测QA

1. Q：要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查，但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查，请问：胃组织要怎样保存好呢？用低温保存，还是用乙醇固定？或者固定后再低温下保存？

A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.

2. 实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题：

Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？

A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？

A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。

Q：（3）TritonX-100是固定剂吧，用了70%的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton X-100固定了？

A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75%的乙醇于-20度固定。

Q：（4）还要设什么内参标准（5%鸡红细胞）吗？

A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。

Q：（5）不用试剂盒行不行啊？

以下提供一个自己的实验步骤供参考：

（1）200×g离心10 min 收集细胞；

（2）弃去上清，PBS漂洗一次，将细胞重悬于预冷的80%乙醇中，-20°C固定24 h以上；

（3）进行流式细胞仪检测前，200×g离心10 min 收集固定后的细胞；

（4）PBS洗涤一次，200×g离心10 min 收集细胞；

（5）将细胞重悬于含100 ug/ml RNase A和50 ug/ml PI的PBS中，室温孵育30 min；

（6）将经PI染色和RNase A消化后的细胞悬液用300目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。

3. Q：流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度？

A：
其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30 min，然后加PI 4度孵育30 min”。

至于染色时使用4度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。上流式前细胞用75%乙醇固定行吗？

4. Q：我养肿瘤细胞，测周期。看到帖子说70%乙醇必须用PBS和乙醇配，用水配细胞会碎裂，有帖子说PBS和乙醇配会出现絮状物。上流式前细胞用75%乙醇固定，就用买来的现成的瓶装75%乙醇，行吗？必须那么严格吗？

A：先用冷PBS悬浮细胞，大约1~2 ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70~75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。

5. Q：我要做流式分析细胞周期，我大概收集了106细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现就发现不了细胞了。这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？

A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：

（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机

（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1 mm 左右的水膜，不要吸完。

（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿

（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。

6. Q：流式细胞PI单染中为什么用RNAse？

A：在测细胞周期时，因为已经在细胞膜打孔了，PI很容易透过细胞膜和DNA结合，但RNA也是核酸，也会被染色，为避免干扰染色前需用RNAse降解RNA。这样PI只染DNA，能精确以荧光强度反映DNA的含量。

7. 最近做了几次流式细胞仪检测细胞周期，发现有几个问题：

Q：（1）我所用的是肿瘤细胞， 但是同样的细胞类型，同样的处理因素，虽然两次独立实验作出来的结果总体趋势都是在某种药物干预后，S期比例下降，但两次结果S期比列具体数值相差很大，同样，G2/M期在干预前后无变化，但两次独立实验数值却相差很大，那么可以说，做流式是每次细胞状态不一样，结果也会相差很大，是不是细胞密度会对结果产生很大影响，那么如果细胞密度在60~70%时和细胞已经长满（90%以上）也会导致各期数值的差异？如果是这样，长满的细胞（不再增殖）是表现的G1或S或G2/M上升还是下降？

A：应该是两批细胞在实验时本身所出周期不同所致，可以在实验前进行细胞的同步化处理，减少批间差异。实验细胞应处于对数生长期，而不能是完全长满，一般在50~80%比较好。自然状态下，不增殖的细胞应该处于G0/G1期。

Q：（2）其次就是结果分析，细胞周期特异性药物如抗代谢药作用后主要表现的是S期比例下降，细胞被阻滞在G1期，自然G1期比列升高。而有些植物药如长春碱类或紫杉醇类，主要作用于M期，那么结果是否表现为G2期比例升高，还是S期也相应升高？还有就是细胞经抗肿瘤药物作用后反而出现的S期升高，可能是那些原因，如何分析？

A：周期特异性药物阻滞哪一期，哪一期就升高，不会使其它阶段细胞增多。

8. Q：我用流式做胃癌细胞周期分析时不出现S、G2/M峰？什么原因呢？自己分析可能为PI没染上色，是不是染色时间太短呢？

A：你用了多少PI染色多久呢？一般来说30分钟够了。我觉得可能是打孔或者rna没有处理掉没有成功，染色时间并不是关键。

9. Q：做流式细胞时，PI 染色，PI的浓度应该是多少？还有就是400目的筛网是什么？不用可以吗？

A：100 ug/ml，一般用400目的筛网是用来将粘在一起的细胞团滤掉的，否则会出现人为的多倍体干扰，分析的时候需要的是单个的细胞，不过如果经验丰富也可以gate掉的。如果你没有条件，建议在染色之前将细胞弹的很散，再进行染色

10. Q：流式细胞仪观察细胞周期样品怎样准备？

A：给你介绍一下我的实验方法，我做的是周期检测，要做平行样，六孔板做的。

（1）收集先弃液，将你要实验（你已经处理好的）的细胞PBS洗两次，加胰酶消化（注意：如果要是加药物或者其他处理过的细胞，弃液和PBS洗液均收集）；

（2）加培养基终止消化，打匀在分别收到各自离心管中（注意，收集过程中及后续过程中枪头不要混用，要不平行样也就没意思了）；

（3）离心，1000 rpm，5 min 弃液；

（4）4度PBS（1到2 ml）洗两次，离心，1000 rpm，5 min 弃液；

（5）加入负20度70%酒精（1到2 ml）打匀，固定，至少半个小时以上，（不做的话，可放入4度冰箱保存2~3周问题不大）；

（6）离心，1000 rpm，5 min 弃酒精；

（7）4度PBS（1到2 ml）洗，离心1000 rpm，5 min 弃液；

（8）4度PBS（1到2 ml）洗，打匀后，将细胞悬液用100 目的纱布直接过滤到流式检测管中；

（9）离心，1000 rpm，5 min 弃液；

（10）加PI染液染色（浓度为50 ug/ml），PBS 32.4 ml ，PI 2.5 mg，Rnase 0.5 mg，（TritonX-100 0.25 ml，枸橼酸钠50 mg，这两我没加也效果不错）加PBS至50 ml，4度避光保存数月。106细胞中加入1 ml PI染液， 振荡器振匀，避光染色至少30 min， 上机检测；

（11）统计分析。