对流免疫电泳技术

一、原理

在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，在电泳时，由于电渗作用的影响，抗体球蛋白不但不能抵抗电渗作用向正极移动，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质带负电荷，将抗原置于负极，将血清抗体置于正极，电泳后则在两孔之间相遇，并在比例适当的部位形成肉眼可见的沉淀线。

本法由于抗原抗体分子在电场作用下定向运动，限制了自由扩散，增加了相应作用的抗原抗体的浓度，从而提高了敏感性，它较琼脂扩散敏感性高10～16倍。本法快速、操作简单。

二、试剂

同免疫电泳。

三、操作方法

1．制琼脂板 以pH8.6离子强度0.05巴比妥缓冲液配成1%～1.5%琼脂凝胶板，厚度2mm～3mm。

2．打孔 琼脂冷却后，按图打孔，打成对的小孔数列，孔径0.3cm～0.6cm，孔距0.4cm～1.0cm。挑去孔内琼脂，封底。

3．加样 一对孔中，一孔加已知（或待测）抗原，另一孔加待测（或已知）抗体。

4．电泳 将抗原孔置于负极端。电压2.5V/cm～6V/cm，或电流强度3mA/cm～5mA/cm，电泳时间30min～90min。

四、观察结果

断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电泳槽过夜再观察。

五、注意事项

1．抗原抗体浓度的比例 当抗原抗体比例不适合时，均不能出现明显可见的沉淀线。所以除了应用高效价的血清外，每份待测样品均可做几个不同的稀释度来进行检查。

2．特异性对照鉴定 为了排除假阳性反应，则在待检抗原孔的邻近并列一阳性抗原孔，若待检样品中的抗原与抗体所形成的沉淀线和阳性抗原抗体沉淀线完全融合时，则待检样品中所含的抗原为特异性抗原。

3．适当的电渗作用在对流免疫电泳中是必要的。当琼脂质量差时，电渗作用太大，而使血清中的其它蛋白成分也泳向负极，造成非特异性反应。在某些情况，琼脂糖由于缺乏电渗作用而不能用于对流免疫电泳。

4．当抗原抗体在同一介质中带同样电荷或迁徙相近时，则电泳时两者向着一个方向泳动。故不能用对流免疫电泳来检查。