酶标对流免疫电泳技术

一、原理

利用酶标记抗原（抗体）和待测抗体（抗原）在电场中向一定方向移动，在比例适当的地方形成沉淀线，通过酶作用底物而显色，指示沉淀线的存在。该法的敏感性大大高于对流免疫电泳。本试验以检测血吸虫抗体为例。

二、材料与试剂

1. 0.02 Mol/l pH 8.6巴比妥缓冲液；巴比妥 0.553 g；巴比妥钠 3.503 g；乳酸钙 0.512 g；H₂O 加至 1 000 ml
2. 0.1 Mol/L pH7.0PBS（0.14 Mol/L Nacl）
3. 0.2 Mol/L pH7.6硼酸缓冲液；硼酸 10.510 g；硼砂 2.860 g；H₂O 加至 1000 ml

三、操作方法

1. 酶标抗原的制备 用1 ml 血吸虫卵抗原（蛋白含量为1.5 mg/ml~2.0 mg/ml）加入3 mg~4 mg 辣根过氧化物酶（蛋白质：酶=1︰2），液体呈棕红色，然后在轻轻搅拌下，缓慢加入50 μl 1%戊二醛，要求在5 min~10 min 内滴加完毕。置20℃~25℃搅拌2 h。装入透析袋，于1000 ml、0.1 Mol/L pH7.0 PBS液4℃透析2天，并换液3次~4次。取出酶标记物加等量纯甘油，使含50%甘油试剂，即为酶标抗原。分装小瓶，存于-20℃中备用。

2. 琼脂凝胶板的制备 取优质琼脂，以0.02 Mol/L pH8.6巴比妥缓冲液制成1%琼脂，溶化后，置于玻片上，制成2 mm 厚的凝胶板。

3. 打孔加样 打6对孔，抗原孔径为0.30 cm，抗体孔为长方形0.2 cm×1.1 cm。抗原、抗体各加5 μl 及50 μl。抗原用上述酶标抗原做1︰20至1︰30稀释。

4. 电泳 抗原孔置于负极，电压4 V/cm ~5 V/cm，电泳时间45 min~60 min，电泳后，于蒸馏水中荡洗1 min~2 min 即可，用滤纸吸去水分，并用毛细吸管吸尽长孔及圆孔中的水液后，即可用底物的溶液显色。

5. 配制底物溶液，现用现配。将饱和联苯胺溶液，加等量pH7.6硼酸缓冲液，然后将上液9份和0.1%过氧化氢1份相混，即为所需的底物溶液。

6. 免疫酶染色 将琼脂凝胶板置于培养皿中，缓缓倾入底物溶液，直至浸没凝胶板为止，置于室温或37℃，经1 h~2 h 用目测可观察反应结果。

四、结果判定

1. 阳性反应：在抗原抗体孔之间呈现明显的棕红色的线条。

2. 阴性反应：不出现棕红色线条者。