柱层析技术简介

一、简介

根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术。

二、技巧和方法

1. 柱层析操作方法的选择

目前，柱色谱分离的操作方式，主要包括常压分离、减压分离和加压分离3种模式。常压分离是最简单的分离模式方便、简单，但是洗脱时间长。

减压分离尽管能节省填料的使用量，但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发，并且有时在柱子外面会有水汽凝结，以及有些易分解的化合物也难以得到，而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。

加压分离可以加快淋洗剂的流动速度，缩短样品的洗脱时间，是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵等。

2. 柱子规格的选择

市场上有各种规格的柱层析分离柱。柱子长了，相应的塔板数就高，分离就好。目前市场上的柱子，其径高比一般在1：5~10范围，在实际使用时，填料量一般是样品量的30~40倍，具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。

如果所需组分和杂质的分离度较大，就可以减少填料量，使用内径相对较小的柱子（如2 cm×20 cm 的柱子）；如果Rf相差不到0.1，就要加大柱子，增加填料量，比如用3 cm 内径的柱子。

3. 装柱

柱层析色谱柱的填装主要有湿法和干法两种，湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。柱子底端的活塞一定不要涂润滑剂，否则会被淋洗剂带到淋洗液中，可以采用聚四氟乙烯材料的阀门。

干法和湿法装柱没什么实质性差别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该有适度的紧密（太密了淋洗剂流速太慢），并且一定要均匀，不然样品就会从一侧斜着流动。

同时柱中不能有大气泡，大多数情况下有些小气泡没太大的影响，因为只要加压气泡就可消失。但是柱子更忌讳的是开裂，开裂会影响分离效果，甚至报废。

4. 溶剂的选择

选择一个合适的溶剂系统是柱层析分离的关键。在选用柱层析洗脱剂时首先要考虑三个方面的因素:溶解性（Solubil2ity）、亲合性（Affinity）和分离度（Resolution）。

溶剂应选择价廉、安全、环保的，可以考虑石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷价格较高，乙醚很易挥发，二氯甲烷和甲醇与硅胶的吸附是一个放热过程，易使柱子产生气泡。其他的溶剂用的相对较少，要依不同需要选择。

另外值得一提的是，由于我们进行的是痕量分析，淋洗剂的纯度必须关注，一般使用农药残留级或HPLC级的，如果是分析纯的必须进行精制。同时溶剂在过柱后最好回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费。

5. 上样

用少量的溶剂溶解样品加样，加完后将底端的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。

加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶解样品的溶剂和样品层有一段距离（2~4 cm），再加压，这样避免了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。

很多样品在上柱前粘性较大，上样后在柱上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为填料对样品的吸附饱和所致。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂（比如DMF，DMSO等）又不能上柱，这样就必须用干法上柱了。

6. 淋洗液的收集和浓缩

用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出，这时可以采用氧化铝作固定相。

柱层析后的淋洗液，由于使用了较多的溶剂，必须进行浓缩，如果待测物具有一定的挥发性，最好使用常压挥发溶剂，否则易导致检测结果偏低。