关于论坛中所有Native PAGE/非变性电泳及蛋白回收的经典总结

1， 电泳结束后，将Marker和少许样品带切下，进行染色和脱色。剩余样品胶置于4 ℃。 根据Marker和被染色的样品带，切下未被染色的胶中蛋白带。

2， 用10mM KcL染色（本室方法为0.3M CUCL染色或250mM KCL）只需要几分钟就可以使蛋白条带呈现乳白色，根据位置切下需要的条带即可，脱色可以用ddH2O，可以不脱。非常方便快捷，无染料污染问题。

总结

Native- PAGE和SDS-PAGE是不一样的，NATIVE-PAGE中蛋白质的迁移不仅和目的蛋白质的带电性质有关，同时也和蛋白质的分子形状以及蛋白质的分子量有关，而SDS-PAGE中，蛋白质本身的性质被SDS所屏蔽，蛋白质的迁移只和蛋白质的分子量有关；一般来说NATIVE-PAGE中蛋白质的迁移要慢一些，所以电洗脱的时间要长一些，尤其是对蛋白质的性质不太了解的蛋白。

此外还有两种从凝胶中分离蛋白的方法

超滤：切下目的条带的胶，放入离心管。直接用MILLIPORE的滤器超滤一下，蛋白就可以提纯了，省去了溶胶的麻烦。

电洗脱

电洗脱装置；Bio-Rad公司的“ELECTRO ELUTER”

2、电洗脱仪： 瑞典Pharmacia

3、AE-6580 洗脱电泳槽等，利用生物大分子在聚丙酰胶或琼脂胶中的不同相对迁移率，将其分离回收。

4、上海邦华科学器材行 Blaid-B型蛋白质回收槽，请看

5、具体方法

电泳后蛋白的复性

在常规PAGE电泳以后，在凝胶中或洗脱后可以检测天然蛋白质的生物活性。SDS电泳后也有这种可能性。从蛋白质中除去所有的SDS，许多蛋白质会恢复活性，或至少恢复部分活性。因为SDS不一定导致不可逆变性，但有许多因子影响活性的恢复。

1）SDS的纯度：市售的SDS常含有DDA等杂质，它们与蛋白质的结合比SDS紧，因而影响蛋白质活性的恢复；

2）蛋白酶的影响：在样品的准备过程中，蛋白酶降解蛋白质，因而影响蛋白质活性的恢复；

3）二硫键对活性没有贡献的蛋白质和非均一亚基组成的蛋白质，最容易被恢复活性；

4）尽可能慢地排除所有结合和非结合的SDS，使变性蛋白质有足够的时间去恢复天然的构象而复性，所需的时间取决于蛋白质的结构；

5）在恢复活性所用的缓冲液中应该包括在电泳过程中被迁移出的辅助因子和辅酶。高浓度底物、氯化钠、甘油和硫还原试剂如DTT的存在也将对酶的活性恢复有利；

6）疏水蛋白质恢复活性时，必须用无离子去污剂或两性离子去污剂替代SDS，以保持蛋白质的可溶性。

其他实验室经验

1，在凝胶中复性是可以做到的。用2.5％triton x-100 洗脱45分钟X2，即可将SDS洗脱出来。可以试一试。先回收再复性的方法不太清楚。

2，有的蛋白可以复性，方法是用将胶在2.5％triton x-100 沁泡1小时，37度摇荡。然后在缓冲液中泡1小时，37度摇荡，再上样前不能加热。不过，只有很少一些蛋白可以复兴，最好的办法环视跑活性电泳，不加SDS。

兔抗仿蜘蛛牵丝蛋白抗体的制备及应用

郭廷晴 赵昀 汪生鹏 董良 陆长德~K~Hp~M~Kp~M~A_中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 上海 200031 )

摘要 将仿蜘蛛牵丝基因s600克隆到GST融合蛋白表达质粒pGEX-KG中, 利用大肠杆菌表达系统表达并纯化了仿蜘蛛牵丝蛋白S600, 以之作为抗原制备了兔抗血清。 S600的氨基酸组分分析与理论值相吻合。 蛋白质免疫印迹发现该抗血清能与天然蜘蛛丝反应, 表明设计的仿蜘蛛丝与天然蜘蛛丝有相似的免疫原性。 为了定量检测仿蜘蛛牵丝蛋白在转基因家蚕丝腺中(或茧壳中)的表达, 建立了用ELISA方法定量检测茧壳中仿蜘蛛牵丝蛋白量的工作系统。

关键词 仿蜘蛛牵丝蛋白; 兔抗血清; 茧壳; ELISA

天然蜘蛛牵丝兼具高强度和高弹性, 机械性能优越等特点, 其结构﹑ 功能和应用研究一直是生物学和材料学领域的热点和难点。 由于蜘蛛吐丝量远比家蚕要少, 又有同类相残的习性而难以群养, 多年来人们致力于发展各种表达系统表达蜘蛛牵丝蛋白。

Lewis实验室最早克隆了编码络新妇蜘蛛(Nephila clavipes)牵丝的两种牵丝蛋白的cDNA, 命名为MaSp1[1]和MaSp2[2]。 在大肠杆菌中表达天然牵丝基因, 发现牵丝基因丢失和重组现象严重, 表达量较低; 这被认为是牵丝基因密码子重复序列太多和GC含量过高所致[3]。 此后的表达研究倾向于使用人工合成的仿蜘蛛牵丝基因[4～7]。 Hinman等[8]总结了已克隆的天然蜘蛛丝基因和cDNA序列, 指出共有4种重复的肽段模体(repeating peptide, peptide motif), 分别为(1)GPGXX/GPGQQ; (2)(GA)n/An; (3)GGX; (4)间隔区。

其中GPGXX/GPGQQ和(GA)n/An存在于MaSp1和MaSp2中, 许多研究者合成的仿蜘蛛牵丝基因也以这两种肽段模体为基础。 Jelinski等[9]发现存在于MaSp1中的90%的(GA)n/An形成了β折叠结构, 位于牵丝纤维的结晶区。 目前认为(GA)n/An和牵丝的强度有关, GPGXX则被认为形成β转角, 与牵丝弹性有关。 我们注意到, 另一种蜘蛛丝蛋白鞭毛状腺丝蛋白(flagelliform silk)含有的肽段模体GGX(Hinman等[8]认为会形成3个一圈的螺旋)可能是使鞭毛状腺丝蛋白成为弹性最好的蜘蛛丝(>200% 伸缩性)的重要原因。

本实验室参考了家蚕丝心蛋白基因中密码子的偏爱, 合成了一个编码了包含有多聚丙氨酸(A)n序列, (GPGXX)序列和(Gly-Gly-X, X为Ala, Gln和Thr)序列的321 bp仿蜘蛛牵丝的单体基因, 在E.coli中逐步加倍至约2400 bp后, 与GFP基因融合, 用电穿孔方法导入蚕卵, 通过“亮茧”表型, 基因鉴定(PCR, Southern 印迹), 及茧壳中GFP的ELISA阳性确定了几个转基因成功的蛾区[10]。

本工作是在以前的工作基础上将仿蜘蛛牵丝的单体基因加倍到600多 bp的一个片段装入原核表达质粒pGEX-KG中, 构建了GST与仿蜘蛛牵丝S600融合蛋白的表达质粒, 并进行原核表达, 分离纯化出单独的仿蜘蛛牵丝蛋白S600, 以之为抗原免疫新西兰兔, 制备抗血清。 S600的氨基酸组分分析与理论值相吻合, 蛋白质免疫印迹证实了所制备的抗血清与抗原的特异性免疫反应, 还发现抗血清能与天然蜘蛛丝反应。 为能应用于快速方便地筛选转基因蚕, 并检测表达量, 我们还建立了ELISA定量检测的方法, 并探讨了影响仿蜘蛛牵丝蛋白表达量测定的各种因素。

1 材料和方法(Materials and Methods)

1.1 材料

1.1.1 菌种、 质粒和试剂 表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)由本室保存; 质粒pAB600﹑ pGEX-KG由本室保存; 新西兰大白兔购自中国科学院上海实验动物中心; 还原型谷胱甘肽, 山羊抗兔IgG抗体(偶联HRP)购自上海华美生物工程公司; ECL荧光显色试剂购自上海普飞公司; PVDF膜为Millipore公司产品; 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker购自TaKaRa公司; 丙烯酰胺(Arc)、N, N'-亚甲双丙烯酰胺(Bis)为Sigma公司产品; 低分子量标准蛋白质为上海西巴斯生物技术开发公司产品; 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自上海生工公司; Glutathione-Uniflow 树脂购自ClonTech 公司; 凝血酶(thrombin)购自Amersham Pharmacia 公司。 其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器 电泳系统为Amersham Pharmacia 公司的Hoefer miniVE型; 电转移仪为Bio-Rad公司的Trans-Blot SD型; 全自动酶标仪为Vermont American Corporation的ELX800型。

1.2 方法

1.2.1 克隆装配相关方法参见《分子克隆》相关部分[11]。

1.2.2 表达与纯化 小量表达时, 携带质粒的BL21(DE3)菌于3 mL LB培养基中摇至A600=0.5～1.0 (氨苄青霉素浓度为100 g/L), 加IPTG(终浓度0.5 mmol/L)诱导1 h, 离心4000 r/min×10 min, 收菌体加4×上样缓冲液煮沸, 12.5% SDS PAGE 分析。 大量表达时, 于1 L 4×YT培养基中摇至A600=0.5～2.0时, 加IPTG(终浓度0.5 mmol/L)诱导1～4 h。 超声破菌, 12 000 g离心除去细菌碎片后, 裂菌上清液用GST亲和树脂纯化(参照BD Biosciences Clontech 使用手册p1-15), 纯化融合蛋白质GST-S600经凝血酶切, 酶切条件为： 1×PBS, 室温反应16 h。 酶切后样品经制备型PAGE电泳分离, 用KCl染色后[12], 割下蛋白质条带, 于透析袋中电洗脱收集, 再对双蒸水透析后, 冷冻抽干。

1.2.3 蛋白质定量 因为仿蜘蛛牵丝蛋白主要氨基酸成分为Gly、 Ala、 Ser, 芳香族氨基酸含量很少, 故不适合用检测生色基团的蛋白质定量方法(如Bradford法)定量。 用A230检测酰胺键数量, 并以氨基酸成分相似的家蚕丝素蛋白作标准曲线, 对仿蜘蛛牵丝蛋白定量。

1.2.4 抗血清制备 仿蜘蛛牵丝蛋白作为抗原皮下注射免疫新西兰兔, 每次免疫抗原量为100 μg左右, 方法参照《分子克隆》[11]。

1.2.5 茧壳蛋白与天然蜘蛛丝的溶解 剪取蚕茧一小块于 9 mol/L LiBr 中65 ℃溶解过夜(蛋白质终浓度10 g/L左右); 取大腹圆蛛蜘蛛网, 无菌水漂洗干净, 晾干后, 按终浓度10 g/L于9 mol/L LiBr 中65 ℃溶解过夜, 未溶解部分离心除去。

1.2.6 PAGE电泳、 Western印迹及茧壳蛋白ELISA实验 天然蛛丝蛋白溶液PAGE电泳前将4倍体积的上样缓冲液(62.5 mmol/L Tris-HCl pH 6.8、 2% SDS、 5% 2-巯基乙醇)加入1倍体积蛋白质溶液中, 煮沸10 min后上样。 Western 印迹及ELISA方法参照《精编分子生物学实验指南》[13]。 ELISA实验时蛋白质包被、 封闭、 一抗温育(使用兔抗仿蜘蛛牵丝蛋白抗血清)、 二抗温育(使用偶联辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗), 条件均为37 ℃作用1 h; 洗涤条件均为洗3次, 每次5 min; 显色条件为： 二抗温育并洗涤, 弃去洗涤液后, 加入100 μL二抗偶联的辣根过氧化物酶底物TMB, 在37 ℃保温20～30 min; 加入100 μL 2 mol/L H2SO4终止反应, 并用酶标仪在450 nm测定吸光度值。 实验中直接取蛋白质的LiBr溶液进行ELISA分析。

2 结果(Results)

2.1 融合蛋白质表达质粒的构

本组保存的质粒pAB600中装有仿蜘蛛牵丝基因片段600 bp, 由BglII/SacI双酶切切出, 装入pGEX-KG BamHI/SacI中, 构建成仿蜘蛛牵丝基因s600与GST的融合蛋白质表达质粒pKG-s600 。 测序证明质粒装配无误。 仿蜘蛛牵丝基因表达产物氨基酸序列。

Fig.1 Map and features of GST-synthetic dragline fusion expression plasmid pKG-s600 Fig.2 Amino acid sequence of the synthetic dragline protein S600

2.2 蛋白质表达、纯化, 氨基酸组分分析及Western 印迹检测

PAGE电泳考马氏亮蓝染色结果, Western 印迹一抗为制备的兔抗仿蜘蛛牵丝蛋白S600抗血清, 稀释2000倍使用。中泳道2上样为GST与仿牵丝蛋白融合蛋白质经凝血酶切后的产物, 酶切下的S600蛋白(15.7 kD)条带明显比GST条带(26.2 kD)浅, 是因为仿牵丝蛋白主要氨基酸成分为甘氨酸﹑ 丙氨酸, 芳香族氨基酸少， 不易被染色; 泳道1表明该抗血清能特异性结合抗原S600, 泳道3、 4表明该抗血清能结合含有S600蛋白的GST融合蛋白质及其部分降解蛋白质。

(A) Sodium dodecyl sulfate/polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the purification of synthetic spider dragline protein by Coomassie blue staining. (B) Western blot analysis of the purification of synthetic spider dragline protein with anti-synthetic spider dragline protein anti-serum. M, molecular weight standards; 1, purified dragline protein; 2, fusion protein digested by thrombin; 3, purified fusion protein; 4, total proteins of E.coli induced by IPTG; 5, total proteins of E.coli containing the expression plasmid but not induced; 6, total proteins of E.coli not containing the expression plasmid.

2.3 抗血清与天然蜘蛛丝蛋白能发生免疫反应
取溶解在9 mol/L LiBr的天然蛛丝溶液, PAGE上样, 天然蜘蛛丝蛋白、 家蚕茧壳蛋白均上样10 μg; Western 印迹表明抗仿蜘蛛牵丝蛋白的兔抗血清能与天然蜘蛛丝蛋白发生免疫反应。 一起电泳的家蚕茧壳蛋白及分子量标准蛋白质未见与1∶2000稀释的抗血清发生免疫反应。

Fig.4Western blot test of natural spider silk proteins with anti-synthetic dragline protein (S600) anti-serum

2.4 用ELISA方法定量检测茧壳中仿蜘蛛牵丝蛋白量的工作系统的建立
为筛选丝腺特异性表达仿蜘蛛牵丝的转基因家蚕以及茧壳中牵丝蛋白表达量的测定, 建立了一个基于ELISA方法的测定系统。 因为茧壳蛋白与仿牵丝蛋白都是丝蛋白, 氨基酸组成, 蛋白质二级结构有相似之处, 茧壳蛋白与高浓度(1∶400稀释)抗仿牵丝蛋白抗血清有一定交叉反应, 故在本工作中要确定牵丝蛋白与茧壳蛋白共包被时, 仿牵丝蛋白含量达到多少是处在可置信的ELISA阳性范围内, 并且作出其定量检测曲线。 ELISA测定在96孔板上进行。

Table 1 amino acid composition analysis of synthetic dragline protein S600 and comparison to the predicted and natural dragline silk fiber composition
Amino acid S600 (%) Predicted (%) Natural dragline (%)
Gly 41.05 45.05 42.2
Ala 26.48 26.73 27.5
Ser 1.95 3.47 3.6
Tyr 0.13 0.00 3.7
Asx 2.50 0.99 1.1
Glx 14.15 11.39 10.3
His 0.00 0.00 0.1
Arg 2.46 1.98 2.4
Thr 2.56 2.97 0.5
Pro 1.92 1.98 1.7
Val 1.71 0.99 0.8
Met 0.00 0.50 0.3
Cys 0.15 0.00 0.1
Ile 0.28 0.00 0.5
Leu 5.89 3.96 4.5
Phe 0.36 0.00 0.4
Lys 1.06 0.00 0.3
Total 99.9 99.9 100
Predicted, means predicted by translation of pKG-S600 DNA sequence; Natural dragline, means electroblotted full length Nephila clavipes dragline protein[14]; Asx, Asp+ Asn; Glx, Glu+Gln.

先分别测定抗原(仿蜘蛛牵丝蛋白S600)及茧壳蛋白的包被饱和曲线，确定抗原(仿蜘蛛牵丝蛋白S600)包被饱和量约为每孔0.08 μg, 茧壳蛋白的包被饱和量约为每孔10 μg; 根据包被饱和曲线, 作抗原(仿蜘蛛牵丝蛋白)与茧壳蛋白单独包被时, 及二者按不同质量比(1∶250、 1∶2500、 1∶25 000)混合包被时的一组抗血清饱和曲线(每孔100 μL, 其中茧壳蛋白含量固定为10 μg; 抗原含量从饱和量0.08 μg开始往下十倍稀释, 以确定茧壳中含有仿牵丝蛋白的阳性检测下限, 以及阳性最显著时的抗血清稀释度)。可见用稀释度为1∶800到1∶3200的抗血清时, 在10 μg茧壳蛋白中混合包被0.004 μg, 0.04 μg仿牵丝蛋白的检测阳性较显著(与包被10 μg纯茧壳蛋白相比)。 因此选择1∶2000稀释度的抗血清, 将不同量的抗原和饱和的茧壳蛋白量混合包被, 作抗原定量检测曲线。

可以看出, 当仿牵丝蛋白S600与茧壳蛋白质的质量比在0.01∶10与0.04∶10之间, 即前者占总含量0.1%～0.4%之间时, A450在0.3～0.75之间呈现较好的线性关系。 但是, 当将S600与剪取的家蚕茧壳混合加入9 mol/L LiBr, 65 ℃保温过夜, 应用ELISA方法检测, 发现检测灵敏度显著下降, S600与茧壳蛋白质的质量比在0.04∶10, 即含量0.4%时已基本检测不出。 S600与茧壳蛋白质的质量比在0.06∶10与0.12∶10之间, 即前者占总含量0.6%～1.2%之间时, A450在0.32～0.63之间呈现较好的线性关系可作为定量检测的工作范围。 因此, ELISA检测下限为仿蜘蛛牵丝蛋白占总含量0.5%左右。

Fig.5 S600 ELISA reaction curves mimic quantitative detection of S600 expression in the cocoon of transgenic silkworm
(A) S600 reaction curve when the antiserum dilution ratio is 1∶400. (B) Cocoon protein reaction curve when the antiserum dilution ratio is 1∶400. (C) Antiserum reaction curves when the weight ratio of S600 to cocoon protein in the mixture varies. a, pure dragline protein (0.08 μg); b, mixture of dragline protein (0.04 μg) and silkworm cocoon protein (10 μg) with the weight ratio 1∶250; c, mixture of dragline protein (0.004 μg) and silkworm cocoon protein (10 μg) with the weight ratio 1∶2500; d, mixture of dragline protein (0.0004 μg) and silkworm cocoon protein (10 μg) with the weight ratio 1∶25 000; e, pure silkworm cocoon protein (10 μg). (D) S600 reaction curves when S600 mixed with 10 μg cocoon protein and the antiserum dilution ratio is 1∶2000. a, S600 protein was not incubated in 9 mol/L LiBr at 65 ℃; b, S600 protein was incubated in 9 mol/L LiBr at 65 ℃. Each data point represents the average from three separate repeats.

3 讨论(Discussion)

本工作在E. coli中表达了GST-仿蜘蛛牵丝S600的融合蛋白质, 经GST亲和柱纯化, 并通过凝血酶水解得到了纯仿蜘蛛牵丝蛋白S600。 GST亲和柱的纯化融合蛋白质中发现有少量降解条带, 这些条带能与抗仿蜘蛛牵丝蛋白的兔抗血清反应, 说明是融合蛋白质的降解产物。

我们表达的仿蜘蛛牵丝蛋白包括了天然蜘蛛牵丝的几种结构单元： 多聚丙氨酸(A)n和富Gly区(包括GGX, GPGXX), 故应与天然蜘蛛丝蛋白有相近的免疫原性。 为验证这一点, 我们采集了大腹圆蛛蜘蛛网, 溶解取得蜘蛛丝蛋白。 蛋白质免疫印迹结果证明抗仿蜘蛛牵丝蛋白S600的兔抗血清能和天然蜘蛛丝蛋白发生免疫反应, 反映了仿蜘蛛牵丝基因设计的正确性, 类似结果尚未见报道。

转基因动植物的大规模初步筛选通常是用PCR方法检测基因插入是否发生, 或观察报告基因(如GFP)有否表达, 未见有用ELISA方法直接检测外源蛋白质表达进行筛选的报道。 PCR方法只能检测基因插入, 并不检测该基因的表达与否; 而GFP等报告基因的观察要求它有一定的表达量, 并保持蛋白质活性﹑ 能激发荧光。 为了检测仿蜘蛛牵丝蛋白表达于家蚕丝腺, 并随蚕丝吐出形成茧壳的情况, 我们模拟茧壳溶解条件, 将大肠杆菌表达的仿蜘蛛牵丝蛋白S600与剪取的家蚕茧壳混合加入9 mol/L LiBr, 65 ℃溶解过夜, 应用ELISA方法检测, 发现检测灵敏度比不经9 mol/L LiBr, 65 ℃处理的显著下降。

检测灵敏度的下降可能是9 mol/L LiBr, 65 ℃处理破坏了仿蜘蛛牵丝蛋白的一部分抗原决定簇的高级结构, 使能与抗原结合的抗体量相应减少之故。 从结果可见, S600与茧壳蛋白质的质量比在0.06∶10与0.12∶10之间, 即前者占总含量0.6%～1.2%之间时, A450在0.32～0.63之间呈现较好的线性关系可作为定量检测的工作范围。 因此, ELISA检测下限为仿蜘蛛牵丝蛋白占茧壳蛋白质总含量0.5%左右。 ELISA方法能检测外源基因的表达并对表达进行初步定量, 适用于大通量地对表达目标蛋白质(而非报道基因)的转基因生物直接检出, 有希望成为一种快捷、 廉价、 有效的转基因检测方法。

但是任何特定的ELISA检测系统有其特定的检测下限, 在本工作中, 茧壳蛋白对抗仿蜘蛛牵丝蛋白抗体的弱的非特异结合, 以及为溶解样品采取的对样品的特殊处理方法(9 mol/L LiBr, 65 ℃), 是限制检测下限的主要因素。 仿蜘蛛牵丝蛋白表达量过低时, 采用ELISA系统检测仍具有一定困难。 对于仿蜘蛛牵丝转基因蚕而言, 希望得到的是高表达的个体, 其表达量应当高于本方法能测定的下限才好。 如果要检测出更低的仿蜘蛛牵丝蛋白的表达量, 制备另一种动物的抗仿蜘蛛牵丝蛋白抗体, 采用夹心法进行ELISA测定将是可以采用的方法。

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