单克隆抗体的制备过程
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1. 杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
2. 单克隆抗体的大量制备
单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。
（1）体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5 ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
（2）体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。
杂交瘤细胞融合后，要进行筛选后才能使用。杂交瘤细胞分为两次：一、筛选出杂交瘤细胞;二、在初选的杂交瘤细胞中筛选出能产生特异性抗体的杂家瘤细胞，这两次筛选的方法和原理各不相同。
腹水的制备过程比较简单：
第一步，提前一周用弗氏不完全佐剂0.5ml注射小鼠腹腔；
第二步，注射佐剂后一周将生长旺盛的杂交瘤细胞离心弃去培养基，用PBS或者不完全培养基重悬后注射小鼠腹腔，一般7-10天左右就可以看到小鼠腹腔明显肿大，此时可以处死小鼠采集腹水，也可以用注射器反复隔日抽采腹水。反复抽采的方法得到的腹水产量比一次性处死得到的腹水产量高（站长用反复抽采的方法得到的最高产量为单只小鼠30.5 ml）。
除了腹腔注射杂交瘤，还可以脾内注射，其方法有点类似脾脏内免疫。具体操作是：提前一周注射弗氏不完全佐剂，注射后一周左右用乙醚麻醉小鼠，剪开背部皮肤，可以看到脾脏，用注射器刺穿背部皮肤，将杂交瘤细胞注射到脾脏里，再用AB胶将伤口处的毛粘好，涂上抗生素即可，7-10天后可见腹水形成。这种方法的优点是对杂交瘤细胞的数量要求少，一般1000个以上的细胞都可以成功制备腹水。
刚采出的腹水含有大量的油脂、巨噬细胞、杂交瘤细胞、腹腔内的上皮细胞、血液中的细胞成份等杂质，尤其是这些细胞成份，如果不除去则可能在腹水的长期保存中慢慢破裂，细胞内的蛋白质成份会释放到腹水中，增加了腹水中的杂质，使纯化变得困难，因此腹水在采集后不管是要长期保存还是立即纯化都应该先离心除去细胞的成份，同时也去掉油脂（油脂的密度比较小，一般都漂浮在腹水表面，用枪吸出丢掉即可）。
单抗的纯化目前主要有这么几种：
(1)盐析/沉淀法；
(2)离子交换法；
（3）凝胶过滤层析；
（4）蛋白A或蛋白G纯化；
（5）抗原亲和纯化。这里仅作一些简单的介绍。
盐析/沉淀法主要有两种，一种是硫酸铵两步法，另一种是辛酸-硫酸铵两步沉淀法。 前一种方法的原理是在高浓度的盐离子条件下（一般是中性盐），蛋白质分子在水溶液中，分子表面的水化膜被会剥夺，从而析出溶液，表现为溶解度减小而析出。
通常用的盐主要是硫酸铵，在50%饱和度的情况下，腹水中除白蛋白外的杂蛋白会析出，但同时免疫球蛋白也会析出，在45%饱和条件下，免疫球蛋白溶解度最小而析出。操作的时候先向腹水中加入等体积的PBS，然后加入硫酸铵固体至50%饱和，具体加多少可以参考文献上给定的硫酸铵固体的溶解度表，《Guide to Protein Purification》一书中就有详细的溶解度表，静置两个小时左右，10000 g离心半个小时后，弃去上清，用PBS重新溶解沉淀，然后再次加入硫酸铵固体至45%饱和，静置两个小时左右10000 g离心半个小时，弃去上清，用少量PBS溶解沉淀，即得到较纯的抗体，因为此抗体中尚有较高浓度的硫酸铵，因此需要对PBS透析，一般透析一天一夜较合适，透析过程中更换透析液两至三次。
如果对纯度要求不是很高，也可以不做第一次沉淀，直接用45%饱和硫酸铵沉淀也可以。 相对于硫酸铵两步沉淀法，辛酸-硫酸铵两步沉淀法得到的抗体更纯。辛酸-硫酸铵两步沉淀法的原理是：辛酸是一种有机酸，在酸性条件下(pH 4.5)，可以使大分子蛋白质沉淀，尤其是PI值在4.5附近的白蛋白，将这些杂蛋白用辛酸沉淀完毕后，再用法将抗体沉淀下来即可。
具体操作：（1）将腹水用0.06 M醋酸钠(pH4.0）按1：3稀释，在4 ℃条件下搅拌加入正辛酸，一般按每毫升未稀释的腹水加入40 ul正辛酸，然后4 ℃静置2 h;
（2）4 ℃10000 g离心20min，可见辛酸因温度低而从系统中结晶析出漂浮在腹水上层，弃去此结晶以及底部沉淀，向上清中加入1/10体积的10×PBS（0.1M，pH 7.4),4 ℃条件下向其中加入硫酸铵固体至终浓度为0.277 g/ml，静置1h以上;
（3）10000 g离心20min；弃上清，将沉淀溶于适量PBS中，再将其装入透析袋对PBS透析（透析液应为抗体体积的100倍以上，最好搅拌），4 ℃过夜；
（4）收集透析好的抗体，直接现用或加入保护剂和防腐剂长期保存。保存条件同多抗保存条件类似。 用这两种纯化出来的抗体纯度可达80-90%左右，损失较少，对抗体的活性损失也较少，试剂成本低，但是操作比较费时。
Protein A和Protein G法则是近年来单抗纯化的主流方向。这里简单讲述一下它们的纯化原理以及方法。 Protein A是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质，分子量为42kD，序列中有6个IgG结合位点，其中5个位点对IgG的Fc片段具有很强的特异亲和力，当达到饱和时，一个Protein A分子平均可以结合两个IgG分子。
目前商品化的Protein A resin（即将Protein A固化在Agarose 或Sephardex微珠上的填料）上的Protein A大多为重组的蛋白，并且在重组过程中去掉了一些非必须区域，有的为了方便洗脱抗体还减少了IgG结合位点的个数（一般都只保留四个结合位点）。
Protein A对很多动物的IgG都有特异性的结合，因此在抗体的纯化中使用较多。Protein G则是链球菌细胞壁上的一种蛋白质，和Protein A类似，它也可以特异性地和IgG的Fc段结合，天然的Protein G除了可以结合IgG外，还可以和白蛋白结合，商业化的用于纯化抗体的Protein G也都是经过重组改造的，重组过程中去掉了可以和白蛋白结合的区域，Protein A和Protein G的主要区别在于它们对不同的亚型的抗体表现出不同的亲和力，另外商品化的Protein G resin一般比Protein A的贵。 鉴于本页只介绍单抗的纯化，这里只列出二者对小鼠亚型的亲和特性：
（1）预处理。买来的Protein A或者Protein G resin一般都泡在20%乙醇中，有的还有特殊的保护剂，使用前需要将它们去掉，简单的方法是把填料装进洗净的纯化柱，然后再用约10倍体积的PBS洗涤一至三次，也可以用PBS在离心管里洗涤，洗完一次后再离心去掉洗涤液，再进行下一轮洗涤。
（2）上腹水。 从小鼠身上采到的腹水往往含有油脂以及体细胞和杂交瘤细胞，因此上柱前需要做一个简单的处理，一般是将腹水先进行离心，离心一般选择5000 g离心20min左右，离心完后，油脂等杂质漂浮在腹水上面，细胞等其它较重的成份则沉在底部，取中间的清澈的腹水即可加到装好的柱子里，然后封住柱子置于摇床上摇动，室温2 h或4度过夜。也可以放在离心管内完成。有时候如果腹水体积比较大，同时为了保证亲和填料可以多次反复使用，可以用0.45微米的膜将腹水过滤一次。另外，据文献报道，将腹水用PBS稀释一倍再与resin孵育效果更好。
（3）洗涤与洗脱。将腹水从亲和柱内流出。如果是用离心管的，可以离心分出腹水,下同。 再用10倍柱体积的PBS洗柱3次，最后用洗脱液将抗体洗脱下即可。洗脱和收集监测过程和多抗的纯化可以完全一样。
（4）抗体保存。这一步也可以和多抗纯化完全一样。
用Protein A或Protein G纯化的好处是得到的单抗纯度相对较高，抗体活性保待也很好，操作方便，另外，由于它们和抗体的结合的区域位于抗体的Fc段，所以它们对大部份的抗体的亲和力表现得都差不多，所在在多克隆抗体的纯化过程中也可以用来浓缩其它方法纯化得到的较稀的抗体。但是这两种填料相对较贵，而且纯化单抗之前需要测定抗体的亚型。
市场上还有一种重组的Protein A和G的重组蛋白偶联的填料，即Protein A/G，它综合了二者的优点，使纯化过程更加方便。 另一个问题是IgM亚型的单抗并不是总是可以用Protein A来纯化的，一个比较好的办法是采用另一种亲和填料来纯化:Protein L resin，其原理和Protein A和G不太一样，Protein L可以特异性地结合抗体的Kappa链。在小鼠体内，至少95%的抗体是κ型的（另5%是λ型的），所以绝大部份单抗都可以用Protein L亲和填料纯化，其中就包括IgM亚型的单抗。 不过需要注意的是Protein L填料的成本也非常昂贵。
5. 杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 点此查看完整实验步骤
6. 单克隆抗体的大量制备
单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。
（1）体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5 ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
（2）体外培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。
杂交瘤细胞融合后，要进行筛选后才能使用。杂交瘤细胞分为两次：一、筛选出杂交瘤细胞;二、在初选的杂交瘤细胞中筛选出能产生特异性抗体的杂家瘤细胞，这两次筛选的方法和原理各不相同。
腹水的制备过程比较简单：
第一步，提前一周用弗氏不完全佐剂0.5ml注射小鼠腹腔；
第二步，注射佐剂后一周将生长旺盛的杂交瘤细胞离心弃去培养基，用PBS或者不完全培养基重悬后注射小鼠腹腔，一般7-10天左右就可以看到小鼠腹腔明显肿大，此时可以处死小鼠采集腹水，也可以用注射器反复隔日抽采腹水。反复抽采的方法得到的腹水产量比一次性处死得到的腹水产量高（站长用反复抽采的方法得到的最高产量为单只小鼠30.5 ml）。除了腹腔注射杂交瘤，还可以脾内注射，其方法有点类似脾脏内免疫。具体操作是：提前一周注射弗氏不完全佐剂，注射后一周左右用乙醚麻醉小鼠，剪开背部皮肤，可以看到脾脏，用注射器刺穿背部皮肤，将杂交瘤细胞注射到脾脏里，再用AB胶将伤口处的毛粘好，涂上抗生素即可，7-10天后可见腹水形成。这种方法的优点是对杂交瘤细胞的数量要求少，一般1000个以上的细胞都可以成功制备腹水。刚采出的腹水含有大量的油脂、巨噬细胞、杂交瘤细胞、腹腔内的上皮细胞、血液中的细胞成份等杂质，尤其是这些细胞成份，如果不除去则可能在腹水的长期保存中慢慢破裂，细胞内的蛋白质成份会释放到腹水中，增加了腹水中的杂质，使纯化变得困难，因此腹水在采集后不管是要长期保存还是立即纯化都应该先离心除去细胞的成份，同时也去掉油脂（油脂的密度比较小，一般都漂浮在腹水表面，用枪吸出丢掉即可）。
具体操作：
（1）将腹水用0.06 M醋酸钠(pH4.0）按1：3稀释，在4 ℃条件下搅拌加入正辛酸，一般按每毫升未稀释的腹水加入40 ul正辛酸，然后4 ℃静置2 h;
（2）4 ℃10000 g离心20min，可见辛酸因温度低而从系统中结晶析出漂浮在腹水上层，弃去此结晶以及底部沉淀，向上清中加入1/10体积的10×PBS（0.1M，pH 7.4),4 ℃条件下向其中加入硫酸铵固体至终浓度为0.277 g/ml，静置1h以上;
（3）10000 g离心20min；弃上清，将沉淀溶于适量PBS中，再将其装入透析袋对PBS透析（透析液应为抗体体积的100倍以上，最好搅拌），4 ℃过夜；
（4）收集透析好的抗体，直接现用或加入保护剂和防腐剂长期保存。保存条件同多抗保存条件类似。 用这两种纯化出来的抗体纯度可达80-90%左右，损失较少，对抗体的活性损失也较少，试剂成本低，但是操作比较费时。
（1）预处理。买来的Protein A或者Protein G resin一般都泡在20%乙醇中，有的还有特殊的保护剂，使用前需要将它们去掉，简单的方法是把填料装进洗净的纯化柱，然后再用约10倍体积的PBS洗涤一至三次，也可以用PBS在离心管里洗涤，洗完一次后再离心去掉洗涤液，再进行下一轮洗涤。
（2）上腹水。 从小鼠身上采到的腹水往往含有油脂以及体细胞和杂交瘤细胞，因此上柱前需要做一个简单的处理，一般是将腹水先进行离心，离心一般选择5000 g离心20min左右，离心完后，油脂等杂质漂浮在腹水上面，细胞等其它较重的成份则沉在底部，取中间的清澈的腹水即可加到装好的柱子里，然后封住柱子置于摇床上摇动，室温2 h或4度过夜。也可以放在离心管内完成。有时候如果腹水体积比较大，同时为了保证亲和填料可以多次反复使用，可以用0.45微米的膜将腹水过滤一次。另外，据文献报道，将腹水用PBS稀释一倍再与resin孵育效果更好。
（3）洗涤与洗脱。将腹水从亲和柱内流出。如果是用离心管的，可以离心分出腹水,下同。 再用10倍柱体积的PBS洗柱3次，最后用洗脱液将抗体洗脱下即可。洗脱和收集监测过程和多抗的纯化可以完全一样。
（4）抗体保存。这一步也可以和多抗纯化完全一样。
