单克隆抗体的制备过程

取4只6周龄雌性BALB/c小鼠皮下注射抗原（20 μg/只），第一次免疫与等量弗氏完全佐剂乳化，0.2 mL/只；两周后进行第二次免疫，抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，皮下注射，0.2 mL/只；两周后进行第三次免疫，免疫方法及剂量同第二次免疫。

第三次免疫一周后，小鼠眼眶采血测其效价，第三次免疫两周后，选择效价最高的小鼠，用不加佐剂的抗原加强免疫，3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。

选择生长状态良好的SP2/0细胞，覆盖瓶底80％时弃上清，以不完全培养基洗涤一次后，用l0 mL不完全培养基将细胞轻轻吹下。

将上述制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50 mL的带盖的融合管中，1000 rpm离心10 min，弃上清。将融合管置于手掌中，轻轻摩擦底部，使两种细胞充分混匀；在37°C水浴中45 s内缓慢加入1 mL预热的PEG-1500到融合管中，边加边轻轻摇匀；

随即在90 s内先慢后快滴加30 mL 37°C预热的不完全DMEM培养基，使PEG稀释而失去作用，37°C静置10 min，1000 rpm离心10 min；弃上清，用60 mL HAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞；分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37°C 6% CO2培养箱内培养；

5 d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基；10 d后用预热的HT换出HAT；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行ELISA检测,两次检测结果为阳性设为阳性克隆孔。

采用有限稀释法对连续两次检测为阳性的细胞株进行克隆化。阳性细胞计数，取100个细胞放入5 mL含饲养细胞的培养液中，即20个细胞/mL，100 μL/孔滴加于96孔细胞培养板，即每孔1个细胞：再将余下的细胞悬液倍比稀释，细胞数为10 个/mL，100 μL /孔滴加于96孔细胞培养板，即每孔0.5个细胞。

第8～9 d时，肉眼可见细胞克隆，对出现单个细胞克隆的孔再按筛选阳性杂交瘤细胞的间接ELISA方法进行筛选。连续进行三次以上亚克隆，判为阳性的细胞株扩大培养，建株冻存。