辛酸 - 硫酸铵法纯化单克隆抗体
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简介
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体不仅纯度和回收率可达 85％ 以上，而且还能保持较好的抗体活性。
原理
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体的基本原理是辛酸（caprylic acid）在偏酸条件下能与血清或腹水中除 IgG 以外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来，IgG 则溶于上清中。再用硫酸铵盐析，即可达到纯化 IgG 的目的。
材料与仪器
器材：电磁搅拌器，低温离心机，-20℃ 冰箱，电子天称，紫外分光光度计，烧杯，量筒，棕色小瓶，透析袋，塑料夹，精密 pH 试纸，转子，离心管，移液器等。。
试剂：
① 小鼠腹水。
② 饱和硫酸铵溶液。
③ 0.06mol/L pH4.8 醋酸盐缓冲液。
贮存液：
A 液 0.06mol/L NaAc：无水 NaAc 0.49 g 加蒸馏水至 100 ml；
B 液 0.06mol/L HAc：冰醋酸 0.36 ml 加蒸馏水至 100 ml。
应用液：取 A 液 60 ml 与 B 液 40 ml 混合即可。
④ 0.1mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）：NaC l8 g，Na2HPO4•12 H20 28.94 g，KH2PO4 2.61 g，加双蒸 馏水至 1000 ml，用 HCl 调 pH 至 7.4，保存于室温。
⑤ 0.15mol/L pH7.4 磷酸缓冲盐液（PBS）：8g NaCl， 0.2g KCl， 2.9 g Na2HPO4•12 H20， 0.2 g KH2PO4 溶于 1000 ml 双蒸水中，用 HCl 调 pH 至 7.4，保存于室温。
步骤
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体的基本过程可分为如下几步：
A 小鼠腹水 4℃、12000 r/min 离心 15 分钟，去除杂质。
B 取 1 份腹水与 2 份 0.06mol/L pH4.8 醋酸盐缓冲液混合，室温搅拌下逐滴加入正辛酸 33μl/ml 稀释的腹水。
C 室温继续搅拌 30 分钟，4℃ 静置 2 小时以上，使其充分沉淀。
D 4℃，12000 r/min 离心 30 分钟，弃沉淀。
E 上清经 2.5μm 滤纸加压过滤后，移入透析袋中，塑料夹夹紧两端，放入 50-100 倍体积的 0.1mol/L pH7.4 PBS 中，4℃ 透析过夜，期间换液 2-3 次。
F 室温搅拌下，在透析后的液体中逐滴加入饱和硫酸铵，使其终浓度为 45％。
G 室温继续搅拌 30 分钟，4℃ 静置 2 小时以上，使其充分沉淀。
H 4℃，12000 r/min 离心 30 分钟，弃上清。
I 将沉淀溶于适量 0.15mol/L pH7.4 PBS 中，装入透析袋，4℃ 条件下对 50-100 倍体积的上述 PBS 透析，期间至少换液 3 次以上，至萘氏试剂测透析外液无黄色。
L 4℃，12000 r/min 离心 3 分钟，除去不溶性沉渣。
J 取少量透析后样品适当稀释后，以紫外分光光度计检测蛋白含量，SDS-PAGE 检测抗体纯度。
K 分装抗体，置于-20℃ 或-80℃ 冰箱保存。
注意事项
1 盐析时，溶液中的蛋白浓度对沉淀有双重影响。蛋白浓度愈高，沉淀所需的盐饱和度极限愈低，杂蛋白可能发生共沉淀的几率也随之增加。因此，在盐析时血清或腹水都应作适当稀释，一般血清作倍比稀释，腹水作 2 倍稀释。
2 辛酸-硫酸铵法也可用于纯化血清中的抗体，此时辛酸用量因抗体来源不同而稍有变化：人血清为 70μl/ml，兔血清为 75μl/ml，小鼠血清为 40μl/ml。
3 不仅盐浓度与抗体的溶解度有关，pH 值对盐析也有影响。因此，选择适当的 pH 值可大大提高对 McAb 的沉淀效果。通常溶液的 pH 值与目标蛋白的等电点相等时，沉淀效果最好。
4 该法主要用于 IgG1 和 IgG2b 的纯化，对 IgA 和 IgG3 的纯化效果及回收率都较差。
来源：丁香实验
