辛酸-硫酸铵法从人血清中纯化IgG

一、实验目的

1、初步掌握从血清中提取纯化IgG的方法步骤。

2、了解辛酸-硫酸铵法纯化IgG 的原理。

二、实验原理

辛酸-硫酸铵法分两步进行。第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀血清或腹水中的白蛋白或其他非Ig蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将Ig沉淀下来，操作步骤如图3-10所示。经SDS-PAGE电泳检测能得到电泳纯度较高的Ig。

三、仪器、原料和试剂

1、仪器

磁力搅拌器、离心机、低温冰柜。

2、原料

抗血清（兔抗鸡血清）。

3、试剂

(1) 乙酸-乙酸钠缓冲液：60mmol/L，pH4.0。

(2) 10×磷酸盐-NaCl 缓冲液（PBS）：100mmol/L PBS，pH7.4。称NaCl 80g、Na2HPO412H2O 29g、KCl 2g、KH2PO4 2g，加蒸馏水溶解，加入100mmol/L EDTA 20ml，用去离子水定容至l000ml。

(3) 透析液 10mmol/L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，含15mmol/L NaCl，pH7.2。

(4) 硫酸铵。

(5) 辛酸。

四、操作步骤

1、抗血清用4倍体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，用0.1mol/L NaOH调至血清稀释液为pH4.5。

2、室温下边搅拌（磁力搅拌器或电功搅拌器），边缓慢滴加辛酸（25ml/L血清稀释液），滴加完后继续搅拌30min。

3、离心（10000r/min，30min），收集上清夜，弃去沉淀。

4、上清液用多层纱布过滤。

5、按1/10体积加入10×PBS，用5mol/L NaOH调至PH7.4。

6、上清液4℃预冷，计算溶液总体积，在4℃按277g/L加入硫酸铵粉沫（45%饱和度），边加边搅拌，加完后继续搅拌30min。

7、离心（5000r/min，15min)），弃去上清液。收集沉淀。

8、沉淀用少量透析液溶解（一般为血清体积的1/10），透析并更换两次透析液或用Sephadex G-50脱盐。

9、Ig溶液在50～55℃水浴中加热20min，离心（5000r/min，20min），上清液-20℃保存或冻干保存。