辛酸－硫酸铵法从人血清中纯化IgG

一、实验目的

1. 初步掌握从血清中提取纯化IgＧ的方法步骤。

二、实验原理

辛酸—硫酸铵法分两步进行。第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉 淀血清或腹水中的白蛋白或其他非Ig 蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将Ig 沉淀下来。经SDS-PAGE 电泳检测能得到电泳纯度较高的Ig。

三、 仪器 、原料和试剂

仪器

磁力搅拌器、离心机、低温冰柜。

原料

抗血清(兔抗鸡血清)

试剂

1. 乙酸—乙酸钠缓冲液：60mmol/L，pH4.0

2. 10×磷酸盐-NaCl 缓冲液(PBS):100mmol/LPBS，pH7.4。称NaCl 80g、Na 2 HPO 4 12H 2 O 29g、KCl 2g 、KH 2 PO 4 2g，加蒸馏水溶解，加入100mmol/LEDTA 20m1，用去离子水定容至l000mL。

3. 透析液 10mmoL／L Na 2 HPO 4 - KH 2 PO 4 缓冲液，含15mmol/LNaCl，pH7.2。

4. 硫酸铵

5. 辛酸

四、操作步骤

1.抗血清用4倍体积乙酸—乙酸钠缓冲液稀释，用0.1mol/LNaOH 调至血清稀释液为pH4.5；

2.室温下边搅拌(磁力 搅拌器 或电功 搅拌器 )，边缓慢滴加辛酸(25mL/L 血清稀释液)，滴加完后继续搅拌30min。

3.离心(10000r/min，30min)，收集上清夜，弃去沉淀；

4.上清液用多层纱布过滤；

5.按l/10体积加入10×PBS，用5mol/LNaOH 调至PH7.4。

6.上清液4℃预冷，计算溶液总体积，在4℃按277g/L 加入硫酸铵粉沫(45％饱和度)，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min。

7.离心(5000r/min、15min)，弃去上清液。收集沉淀。

8.沉淀用少量透析液溶解(一般为血清体积的1/10)，透析并更换两次透析液或用Sephadex G-50脱盐。