Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体
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简介
目前约70％-80％的抗体纯化使用Protein A/G亲和层析法。Protein A与IgG的结合强度很大程度上依赖于该抗体的种属和亚类（参见表7-2），而Protein G对于大多数哺乳动物的IgG则有着更高的亲和力，因此，Protein G可用于纯化不能与Protein A很好结合的哺乳动物单抗或多抗IgG的纯化。
原理
Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体的基本原理是 Protein A/G 能特异性地与抗体的 Fc 段结合，因此 Protein A/G 亲和层析柱可用于抗体（单抗和多抗）的分离纯化，具有极高的选择性。经过一步亲和层析，即可从腹水、杂交瘤培养上清或免疫血清等样品中得到高纯度（＞95％）的抗体。
材料与仪器
器材：Protein A/G 亲和层析柱，FPLC 层析系统。
试剂：
① 上样缓冲液：0.02mol/L PBS，pH7.4。
② 洗脱液：pH3.0-4.0、0.02mol/L 柠檬酸缓冲液，或 pH3.0、0.2mol/L 甘氨酸-HC1 缓冲液。
③ 再生液：0.1mol/L 乙酸
步骤
Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体的基本过程可分为如下几步：
A 样品预处理：小鼠腹水于 4℃、12000 r/min 离心 15 分钟，以除去较大的凝块。经上样缓冲液倍比稀释后，0.45μm 滤膜过滤。
B 平衡：以 1 ml/min 的流速，用 5-10 倍层析柱体积的上样缓冲液平衡层析柱，至流出液 pH 值为 7.4。
C 上样：预处理过的腹水上层析柱，保持 1 ml/min 流速，继续用上样缓冲液流洗 5～10 倍层析柱体积至基线稳定（即杂蛋白完全洗脱）。
D 洗脱：用洗脱液洗脱柱结合抗体，同时应用 FPLC 层析系统进行实时监测，当观察到基线开始上升，即出现洗脱峰时，每管 3 ml 收集流出液，直至洗脱峰回到基线，并立即用 1.0mol/L pH9.0 的 Tris-HC1 缓液调整收集的各管流出液 pH 值至 7.0。
E 再生：保持 1 ml/min 流速，用 3～5 倍层析柱体积的再生液淋洗柱子。
F 平衡：继续用 5～10 倍层析柱体积的上样缓冲液重新平衡层析柱，至流出液的 pH 呈中性，再用 10 倍层析柱体积的三蒸水平衡，可重复使用。
G 浓缩：合并调至中性的各管洗脱液，采用超滤离心管进行浓缩，最后以 0.15mol/L PBS（pH7.4）调整到合适体积，行 SDS-PAGE 鉴定纯度，BCA 法进行抗体定量，分装冻存。
注意事项
1 纯化前所有缓冲液、样品及层析柱都必须平衡至室温，以避免产生气泡。
2 纯化前样品、缓冲液须用 0.45μm 滤膜过滤去除颗粒性物质，以防层析柱被堵塞而降低纯化效果。
3 使用经饱和硫酸铵粗纯的样品不仅可获得更好的纯化效果，还可适当延长亲和层析柱的使用寿命。
4 加样后，让样品在亲和柱内滞留一定时间（约 30 分钟）可提高亲和柱的纯化效率。
5 在酸性条件下洗脱的抗体必须立即中和到中性（pH7.0 左右），以利于维持抗体的生物学活性，避免抗体失活。
6 在使用和保存层析柱时，应避免柱内液体流干，以防气泡进入。
7 为确保层析柱的使用寿命和载量，及时清洗非常重要，清洗完成后用上样缓冲液重新平衡。
8 层析柱可于 4℃、20％ 乙醇中长期保存。
来源：丁香实验
