iPS细胞建立的多种选择

四因子作用

那么,是否可以直接应用相关转录因子对体细胞进行重编程而逆转终未分化细胞的发育潜能, 进而表现出ES细胞那样的多潜能性呢？Takahashi和Yamanaka{4}选择24种在小鼠早期胚胎ES细胞或者肿瘤细胞中丰富表达的转录因子, 通过筛选、组合, 发现用Oct4, Sox2, c-Myc和Klf4 4个因子(这4个因子也被称为Yamanaka因子)可以有效地将胎鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF细胞)和小鼠尾尖成纤维细胞诱导形成形态和生长特点类似ES细胞的克隆, 即iPS细胞。而且, 这些iPS细胞表达ES细胞的特异性标志基因。

为何仅仅几个因子的导入如何就能够诱导体细胞发生重编程而具有多能性呢？根据目前的研究研究结果可知, ES细胞的多能性受到转录因子网络和表观遗传学的复杂调控, 但实际上，仅靠操纵几个基因的表达就可诱导出多能性的体细胞。接下来介绍导入的这几个因子Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 和Oct4/Sox2/Nanog/Lin28在多能性调控中的作用. Oct4, Sox2 和Nanog 这3个转录因子在ES 细胞多能性的维持中发挥的关键作用已经为人们所熟知。

Oct4 是多能性调控中一个至关重要的因子, 缺失了 Oct4, 根本无法得到ES 细胞;要维持多能性, Oct4 表达水平也必须受到严格控制,Oct4 表达不足或过多都会导致ES 细胞的分化。Oct4 对于很多基因的调控需要与Sox2 进行协同作用。 Sox2 的表达虽然不局限于多能性细胞, 但它对早期胚胎发育和抑制分化也十分重要. 缺乏Sox2的胚胎无法形成上胚层(epiblast), 在ES 细胞中阻断Sox2 的功能造成ES 细胞的分化。 Nonog 的转录受Oct4和Sox2 的共同调节, 它的缺乏将导致细胞自发地向原始内胚层细胞分化。 基因组范围的分析结果发现,在小鼠和人类的ES 细胞中, Oct4,Sox2 和Nanog 共同调控着许多靶基因, 其中很多基因的产物是对发育至关重要的转录因子.

Oct4,Sox2 和Nanog 三个转录因子一起形成了ES细胞的调控系统, 其中牵涉了自调节和前馈等多种机制。 c-myc是一种广为人知的原癌基因, 它对于某些成体干细胞的自我更新起一定作用。c-myc 是Lif/STAT3 和Wnt 信号通路的一个主要的下游基因, 这两条信号通路对于多能性的维持都很重要. Klf4 具有癌基因和肿瘤抑制基因的双重特性。它的过表达可以维持Oct4 的表达, 并抑制ES 细胞的分化; 它可以协同Oct4 和Sox2, 从而调节某些基因的转录。 Lin28在许多物种当中是一种控制多种细胞发育的负调控基因。 在人类和小鼠ES 细胞中, 随着ES 细胞的分化, Lin28 的表达下降。

优化建系方法

早期建立iPS细胞的方法为：利用逆转录病毒介导表达4个Yamanaka因子, 然后将细胞在ES细胞培养液中培养, 再用抗性基因筛选多潜能性相关启动子的激活，如Oct4和Nanog启动子，在得到细胞形态相似的iPS细胞后，鉴定iPS细胞的多潜能性。

这些方法构建iPS细胞的效率很低, 细胞多潜能性不均一,而且有内在安全问题, 如病毒的插入突变c-Myc的致癌性, 使其仍无法应用于临床治疗。为解决这些安全问题和提高iPS细胞建系的效率,人们从多方面改进构建iPS细胞。

1. 转座子技术

英国和加拿大科学家首次不用病毒载体培育出更安全的诱导多功能干（iPS细胞)。他们的研究工作是以日本京都大学科学家山中伸弥等人两年前开拓的一种方法为基础的。山中伸弥及其同事将4个基因植入皮肤细胞，使之被诱导为多功能干细胞，是干细胞研究的重大突破。不过，他们移植基因所用的载体是一种逆转录病毒，这就意味着这种方法可能会让使用iPS细胞的病人增加患癌症的风险。为了避免这一技术缺陷，此次英国和加拿大科学家使用的是转基因作物领域常用的“转座子”技术，它能把称作“转座子”的基因序列插入到目标基因组中。研究人员利用老鼠和人类的皮肤细胞进行了试验，结果显示重组后的细胞株完全具备了胚胎干细胞的特征。

2. 减少癌变风险

日本科学家仅用两个移植基因培育成了人类诱导多功能干细胞(iPS细胞)，日本庆应大学教授冈野荣之的研究小组，仅用先前培育iPS细胞所用4个诱导基因中的两个，即“0ct3／4”基因和“Klf4k”基因，也成功培育出了iPS细胞。因为除了使用逆转录病毒作为基因移植的载体这一因素外[17]，造成iPS细胞诱发癌症风险的因素还与先前研究人员使用的4个诱导基因中的一个名为“C-Myc”的基因相关。所以日本科学家的最新方法也可以减少iPS细胞移植后的癌变风险。

3. 高效快速建立iPS细胞

我国科学家从羊水细胞中快速建立人类iPS细胞。继前不久在世界上首次得到完全由诱导多能干细胞(即iPS细胞)发育的小鼠之后，我国科学家在iPS细胞研究领域又取得重大进展：首次从孕妇产前的羊水细胞中高效快速建立iPS细胞，所需时间只有6天，为目前人类iPS细胞相关报道中最短。最近在线发表于国际权威杂志《人类分子遗传学杂志》上的这项成果，是由中科院上海生命科学院／上海交大医学院健康科学研究所金颖研究员带领的干细胞研究组与上海新华医院陈方教授合作完成的。据金颖研究员介绍，此前科学家已经成功地将小鼠、大鼠、猕猴、猪和人的体细胞诱导成为iPS细胞，诱导技术也产生了巨大革新，如减少外源转录因子的种类，使用非整合病毒，质粒法等等。“目前关于人类诱导多能干细胞的研究还处于起步阶段，所采用的供体细胞还仅仅局限在人包皮成纤维细胞、表皮细胞、毛囊细胞等少数细胞类型。

更为棘手的是，这些细胞被重编程为iPS细胞所需要的时间比较长(通常为16～35天)，且效率很低，这大大增加了在个过程中细胞的变异风险。”金颖说，“因此，如何找到一种理想的人类体细胞来源，是全世界科学家的重点关注课题。”据介绍，博士研究生李春亮等在金颖研究员指导下，从孕妇产前诊断时剩余的羊水细胞中发现一部分特殊类群，它们在病毒介导的四种因子诱导下，感染后第二天发生形态上的显著变化，第四天出现人胚胎干细胞类似形态的克隆，第六天就可以挑选后进行建系。研究人员对建立的8株人类诱导多能干细胞进行进一步鉴定后发现，这些细胞能够长期在体外稳定传代并保持体外长期传代核型正常，维持自我更新，蛋白和转录水平高表达全能性的标志基因。诱导多能干细胞的主要应用是分化和细胞移植。研究人员按照国际标准尝试了羊水细胞来源的iPS细胞的体外、体内分化潜能，结果发现，iPS细胞能够分化成包括神经前体细胞在内的各种人体细胞。

提高iPS细胞的制备效率

1. 基因的阻断

自从iPS细胞发现以来，科学家们已经通过导入转录因子成功地将多种体细胞诱导为iPS细胞，但诱导效率很低一直是iPS技术的主要障碍。转录因子c-Myc是一种原癌基因，人们试图将这一基因去除以降低致癌性，然而，c-Myc去除后致癌性虽然降低了，诱导效率却更低了。2009年9月，Hong等H J发现，去除c-Myc基因后用siRNA 阻断一个名为p53的基因，可以将皮肤细胞转化为iPS细胞的成功率提高至10％左右，大约是原有转化率的百倍。

研究证明，p53是调控细胞程序重排的关键因子，它关系到转化效率的高低。DNA芯片的分析结果发现，在小鼠和人的成纤维细胞中有34个与p53调节有关的基因，对这些基因的功能分析表明，阻断p53—p21通路不仅提高了iPS细胞的转化效率，也降低了iPS 的致癌性。更为重要的是，沉默p53基因不仅可用于病毒载体诱导技术，而且对质粒或是蛋白诱导转化的技术也同样可行。

2. 协同作用

北京大学邓宏魁教授在诱导人iPS细胞时，筛选了一系列的相关基因，发现p53基因的干涉小RNA和基因的导入可以协同作用，将iPS细胞的诱导效率提高近100倍，即使不用原癌基因c-Myc，也能高效、稳定地诱导人iPS细胞的形成。

3. 脂肪干细胞的诱导

2009年9月，斯坦福大学研究人员Sun等l5州发现，与皮肤成纤维细胞相比，脂肪干细胞(Humanadipose stem cells，hASCs)更容易被诱导为iPS细胞，且产生的iPS细胞安全性更高。他们发现，在脂肪干细胞和皮肤成纤维细胞中分别加人能够编码4种转录因子的基因后，约有万分之一的皮肤成纤维细胞转变为iPS细胞，而转变为iPS细胞的脂肪干细胞比例达到2％。，是前者的20倍。诱导iPS细胞涉及的4种转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c—Myc)在皮肤成纤维细胞中基本不表达或表达水平很低。

脂肪干细胞内两种转录因子的表达水平高于皮肤成纤维细胞，这表明，在初始状态下，脂肪干细胞更容易被诱导。利用脂肪干细胞诱导的iPS细胞能够分化成人体内的神经细胞、肌肉细胞以及肠上皮细胞等。此外，利用脂肪干细胞培养iPS细胞不需要饲养细胞，这无疑提高了其安全性。因hASCs为iPS细胞提供了更好的体细胞来源，将来当iPS细胞应用于临床治疗时，可选择适当的供体细胞种类，既保证了较高的诱导效率也提高iPS细胞的安全性。

4. iPS细胞诱导的氧环境

培养环境的氧浓度对iPS细胞的诱导效率也有影响[22]。Yamanaka等人发现机体内的干细胞总是集中于氧气相对少的地方，于是，他们在利用人体皮肤细胞培养iPS细胞时把培养环境的氧浓度从通常的21％降到5％，发现iPS细胞的生成效率可提高到原来的2．5倍至4．2倍。但如果进一步降低氧浓度到1％，就会适得其反导致部分细胞死亡。诱导鼠的皮肤细胞时同样也验证了5％的氧浓度是最合适的。

因此，他们认为，通过降低培养环境的氧浓度，并且使用细胞癌变可能性较小的培养方法，就可高效地获取更高品质的iPS细胞。2009年10月，美国斯克里普斯研究所丁盛博士领导的研究小组 将焦点集中在了可生成结缔组织的成纤维细胞生成的自然过程一间质一上皮细胞转化的研究上，他们发现两种化学物质的组合，在促进成纤维细胞转化成干细胞方面的效用最高，比传统方法的效率高100倍。随后，研究人员又锁定了一种名为Thiazovivi的新型化合物，将此种化合物与SB43142和PD0325901结合使用，可提高效率200倍，同时将转化周期由原来的4周缩短到2周 。

5. 添加物的作用

2009年12月，中国科学院广州生物医药与健康研究院裴端卿带领的研究小组另辟蹊径，将研究方向放到细胞外环境一培养基成分上，通过在培养过程中添加维生素C可使iPS诱导效率提高10倍，并通过老鼠和人细胞实验发现，培养时添加维生素C可促进相关基因表达推动体细胞进入重编程状态。他们用缜密的实验设计证明了外因在iPS中具有重要作用。此外，美国哈佛大学研究人员还发现，添加特殊的化合物可将体细胞诱导iPS的效率提高100多倍 。

在诱导过程中，他们使用了4种遗传基因，同时加入了7种包括可阻碍特定蛋白质合成的化合物，结果显示，没有添加化合物时，遗传基因的导入效率为0．01％～0.05％，而加入了一种叫“巴尔普罗酸”的蛋白质合成阻碍剂之后，导人效率竞升至9．6％～14％。同时，最新的报道也发现，丁酸盐处理可以显著提高人iPS诱导效率。

iPS细胞的安全性

iPS研究先驱日本京都大学教授山中伸弥教授带领团队在新一期《自然·生物技术》杂志上报告说，动物实验证明，用不同种类的体细胞培育出的诱导多功能干细胞（iPS）移植后使实验鼠出现肿瘤的危险性存在很大差异。研究人员分别利用小鼠胚胎的皮肤细胞、成年小鼠的胃细胞、尾巴的皮肤细胞以及肝脏细胞培育iPS细胞。利用不同的体细胞和培育方法，研究人员共培育出36种iPS细胞。接着，他们又使这36种iPS细胞都分化成具备演变成神经能力的细胞，并把这些细胞植入另一些实验鼠的大脑。

结果显示，被植入分化细胞来自成年小鼠尾巴皮肤细胞的实验鼠中有83％体内出现了肿瘤；被植入分化细胞来自于小鼠胚胎皮肤细胞的实验鼠中只有8％出现肿瘤；而如果实验鼠移植的分化细胞来自成年小鼠的胃细胞，其体内没有出现肿瘤。研究还发现，利用含有癌症基因的体细胞培育iPS，对肿瘤的发生几率并无显著影响。诱导多功能干细胞能分化生成各种组织细胞，同时又回避了伦理问题，被视为未来再生医疗的重要材料。上述研究表明，确保iPS细胞对治疗的安全性，最重要的是选择何种体细胞作为培育iPS细胞的原料。