简介
诱导性多潜能干细胞（iPS 细胞）是具有形成人和动物个体所有类型细胞的多向分化潜能并自我更新的一类细胞。iPS 细胞不仅可以表现为类 ES 细胞的特性，还避免了 ES 细胞的伦理道德问题，解决了多潜能性细胞的来源问题；避免了免疫排斥，为发育生物学以及组织器官构建的研究工作提供了模型；为研究特异性疾病的药物治疗提供了检测数据，对提高药物的效价、降低药物对机体的毒性等方面具有深远意义。
材料与仪器
器材：
① 移液枪、枪头
② 超低温冰箱
③ 培养皿
④ 离心机、培养箱
试剂：
① 材料：小鼠
② 促性腺激素
③ PBS、EDTA 溶液、聚凝胺溶液
④ 胰酶、青霉素、链霉素、丝裂霉素-C
⑤ 液氮、乙醇、明胶
步骤
小鼠 iPS 细胞的制备的基本过程可分为如下几步：
1．建立小鼠胎儿成纤维细胞系
（1）脱颈处死 13.5 天孕鼠，分离出子宫并用 PBS 浸洗。
（2）用手术镊将胚胎从胎盘和周围膜系组织分离开，去除头、性腺和内脏组织。
（3）将胚胎转移至一个新 100 mm 皿进行 PBS 清洗，剪刀剪碎组织，放于含有 0.1% 胰酶/0.1 mmol/L EDTA 溶液的 50 ml 离心管，于 37 ℃ 消化 20 分钟，重新加酶，再次消化。
（4）加入等体积 FP 溶液（含 10% FBS，50 U＆50 mg/ml 青霉素和链霉素的 DMEM）中止消化，吹打数次以帮助组织破碎。
（5）室温（20～25 ℃）放置 5 分钟以沉降大块组织，取上悬液体于离心管进行离心，1200 r/min x 5 min，弃上悬液并用新鲜液体重悬。
（6）计数细胞，并调节细胞浓度至 1 x 10% ml。一般约 1 x 10 细胞/胚胎，1 x 10 细胞/100 mm 皿于 37 ℃，5% CO2 培养 24 小时。
（7）次日，PBS 清洗去除未贴壁细胞，待细胞铺满皿底，换掉 FP 液，用 PBS 清洗一次，1 ml 0.05% 胰酶/0.53 mmol/LEDTA 消化 5 分钟，加入 9 ml FP 液并吹打成细胞悬液，传代按 1:4 进行（用于 iPS 诱导的 MEFs 代次最好选用 3 代以内）。
2．饲养层细胞准备
（1）复苏 SNL 细胞
1）由液氮罐中取出 SNL 冻存管，迅速放入 37 ℃ 水浴锅中，并晃动冻存管直到融化。
2）乙醇擦拭冻存管盖及冻存管壁，将管内冻存悬液转移入预先准备的 SNL 液体中，800 r/min x 5 min，弃去上液。
3）重新加入 10 ml SNL 液体重悬细胞，转入明胶铺被的 100 mmI 皿中，于 37 ℃，5% CO2 培养至细胞 80%～90% 汇合。
（2）SNL 细胞传代
1）弃废液，PBS 洗细胞，弃 PBS，加入 0.25% 胰酶/1 mmol/L EDTA 每皿 0.5 ml，孵育 1 分钟。
2）加入 4.5 ml SNL 液体，并吹吸成单细胞，按 1:16 比例传代，于 37 ℃，5% CO2 培养直至细胞汇合率 80%～90%
（3）丝裂霉素-C 处理 SNL 细胞
1）每皿 SNL 细胞加入 0.3 ml 浓度为 0.4 mg/ml 的丝裂霉素-C，混合均匀，于 37 ℃，5% CO2 培养 2.25 小时（丝裂霉素-C 终浓度为 12 μg/ml）。
2）孵育完成后，弃所有液体，并用 PBS 洗两次。
3）弃 PBS，加入 0.25% 胰酶/1 mmol/L EDTA 0.5 ml，液体盖满皿底，室温下 1 分钟，加入 5 ml SNL 液体以中和胰酶作用，吹吸成单细胞。
4）收集悬液，细胞计数，将细胞接种于明胶铺被的皿底（1x10° 细胞/100 mmIIL）。
3．Plat-E 细胞准备
（1）细胞复苏
1）由液氮罐中取出 Plat-E 冻存管，迅速放入 37 ℃ 水浴锅中，并晃动冻存管直到融化。
2）乙醇擦拭冻存管盖及冻存管壁，将管内冻存悬液转移入预先准备的 SNL 液体中，1000 r/min x 5 min 离心，弃去上液。
3）重新加入 10 ml FP 液体重悬细胞，转入明胶铺被的 100 mmI 皿中，于 37℃，5% CO2 培养。
4）次日，换液并加入 1 μg/ml 嘌呤霉素和 10 μg/ml 杀稻瘟菌素，置培养箱中培养至汇合率 80%～90%。
（2）传代
1）加入 PBS 洗后，加入 0.05% 胰酶/0.53 mmol/L EDTA 每皿 4 ml，消化 1 分钟，吹打，用 10 ml FP 液重悬，1000 r/min x 5 min 离心，弃去上液。
2）加入相当 FP 液体，重悬成细胞悬液，以 1:4～1:6 的比例接种到新的 100 mmI 皿中，细胞培养 2～3 天会铺满皿底。
（3）转染前准备
1）用 PBS 清洗细胞，加入 0.05% 胰酶/0.53 mmol/L EDTA 消化 1 分钟，用 10 ml FP 液重悬，1000 r/min x 5 min 离心，弃去上液。
2）重悬细胞，调整细胞浓度至 8 x 10/ml，接种 8 x 10/100 mmIIL，于培养箱培养。
（4）转染
1）吸取 0.3 ml DMEM 液体于 1.5 ml 管中，加入 27μl Fugene 6 转染试剂，手指轻弹管壁以混合均匀，室温放置 5 分钟。
2）加入 9 μg pMXs 质粒 DNA（编码 Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc）逐滴加入到上述管中，轻弹混匀，放置 15 分钟。
3）将上述混合物逐滴加入至 Plat-EI 皿 L，于培养箱孵育过夜。
4）弃转染液，加入 10 ml 新鲜 FP 液，培养。
4．成纤维细胞准备
（1）培养 MEF（约 2 x 10/100 mm，代次在 3 代以内）至 90% 汇合度。
（2）10 ml PBS 洗细胞，弃 PBS 加 0.05% 胰酶/0.53 mmol/L EDTA，每皿 1 ml，培养箱孵育 10 分钟。
（3）加入 9 ml 培养液，将消化得到的单细胞转移至 50 ml 离心管。
（4）细胞计数，调整细胞浓度至 8 x 10/ml，加 10 ml 细胞悬液于经丝裂霉素-C 处理的 SNL 的 100 mm 皿中，培养过夜。
5．逆转录病毒感染
（1）收集上述 Plat-E 培养液，经 0.45 μm 细胞滤器过滤，转入 15 ml 管中。
（2）加 5 ml 的 8 mg/ml 的聚凝胺溶液于上管中，吹打混匀，终浓度为 4 μg/ml。
（3）弃成纤维细胞培养液，加入 10 ml 上述转染混合液中，培养过夜。
（4）24 小时、48 小时后换新鲜 FP 液体。
（5）为 Fb x 15 筛选，换液 10 mlES 培养液，补充 0.3 mg/ml G418，换液 3 次。
（6）为 Nanog 筛选，培养液，中加入嘌呤霉素，终浓度为 1.5 μg/ml。
（7）每天换液直至克隆出现（约为感染后 1 周），约 20 天可挑克隆。
6．挑克隆
（1）加入 20 μl 0.25% 胰酶/1 mmol/L EDTA 每 96 孔；弃液，加 PBS 10 ml。
（2）弃液，再加入 5 ml PBS，吸取挑起的克隆转入上述 96 孔板中，孵育 15 分钟。
（3）加入 ES 培养液每孔 180 μl，吹打克隆成单个细胞。
（4）转移细胞悬液于铺有 SNL 饲养层细胞的 24 孔板，加入 300 μl ES 培养液，培养箱孵育。
7．iPS 培养
（1）弃液，1 ml PBS 清洗细胞。
（2）去尽 PBS，加入 0.25% 胰酶/1 mmol/L EDTA 0.1 ml，放于培养箱孵育 10 分钟。
（3）加 0.4 ml ES 培养液（含 15%FBS，2 mmol/LL-谷氨酰胺，1 x 10 mol/L 非必需氨基酸，1 x 10mol/L β-巯基乙醇，50U ＆ 50 mg/ml 青霉素和链霉素的 DMEM 液），吹打至单细胞悬液，转移至 6 孔板，加入 1.5 ml ES 培养液，培养箱培养至汇合度 80%～90%。
8．iPS 冻存
（1）弃液，加入 2 ml PBS 清洗。
（2）去除 PBS，加入 0.3 ml 0.25% 胰酶/1 mmol/L EDTA，培养箱孵育 10 分钟。
（3）加入 2 ml ES 培养液中和胰酶作用，吹打成单细胞，计数，800 r/min x 5 min 离心。
（4）弃上液，重悬细胞调节细胞浓度至 2 x 10/ml。
（5）配制细胞冻存液（含 20% DMSO 的 ES 培养液），加入离心后细胞，吹打均匀，分入冻存管，放于冻存盒，后转入 - 80 ℃ 冰箱过夜（为长期冻存，可放于液氮罐储存）。
来源：丁香实验
