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大鼠前体脂肪细胞的原代培养操作步骤

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1. 乙醚麻醉致死大鼠(3~5 weeks)/小鼠(1~2月,年龄稍大可保证细胞数量)注:1、建议用大鼠做,小鼠取样时,细胞数量偏少,较难养活。2、对于大鼠的年龄,好像要求不太严格,文献上记载一般用3~5 weeks,但我用12 weeks的大鼠做也能成功。

2. 75%乙醇中消毒5~15min。

3. 无菌条件下取腹股沟部、肾、附睾周围的脂肪组织,用Hanks(Hanks配置较麻烦,用PBS也无妨)反复冲洗3次。

4. 用剪刀将脂肪组织剪成1mm小块,置于1mg/ml胶原酶中,37℃水浴(空气)摇床100rpm消化1~3 h。

5. 1000 rpm离心5min,去除漂浮的脂肪细胞及培养液。

6 .沉积的细胞用红细胞裂解液[2]再次配成细胞悬液,37℃孵育10 min,以去除污染的红细胞。

7. 150μm尼龙网过滤,Hanks液洗涤并离心2次,每次1000rpm,5min。注:第六步和第七步我做时省略了。

8 .沉积的细胞用培养基A制成细胞悬液,调节浓度2×105/ml接种于培养瓶中。置37℃,体积分数5% CO2培养箱内孵育72hr后换液。

9. 一周以后可以传代。

细胞的分化

细胞贴壁72 h后Hanks轻轻洗去培养瓶内未粘附的物质,换用培养基C诱导和维持脂肪细胞分化,3d以后更换为培养基B,以后每三天换一次液。

培养基A(增殖培养基):

DMEM/F12 11.2 g/L

小牛血清 10 %

L-Glutamin 0.35 g/L

Hepes 15 mmol/L

NaHCO3 15 mmol/L

青霉素 100 U/ml

链霉素 100 µg/ml

培养基B(诱脂培养基1):

DMEM/F12 11.2g/L

NaHCO3 15 mmol/L

Hepes 15 mmol/L

泛酸盐 17 µmol/L

生物素 33 µmol/L

人转铁蛋白 17 µmol/L

青霉素 100 U/ml

链霉素 100 ug/ml

氢化可的松 100 nmol/L

胰岛素 60 nmol/L

T3 0.2 nmol/L

培养基C(诱脂培养基2):

DMEM/F12 11.2 g/L

小牛血清 10%

IBMX 0.25 mmol/L

L-Glutamin 0.35 g/L

Hepes 15 mmol/L

NaHCO3 15 mmol/L

青霉素 100U/ml

链霉素 100ug/ml

0.22 µm过滤除菌,-20℃保存。

红细胞裂解液:

EDTA 0.1 mM

NH4Cl 150 mM

K2HPO4 5.7 mM

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