正常大鼠前脂肪细胞的培养

实验材料：

1. 细胞来源：4周龄雄性Wistar或其它品系大鼠；

2. 清洗液：不含Ca²⁺ 和Mg²⁺ 的PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.4；

3. 消化液：2mg/ml胶原酶溶液。用DMEM培养液配制，并加入牛血清白蛋白20mg/ml；

4. 培养液a：DMEM培养液，10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素；

5. 培养液b：在培养液a中补充生物素33μmol/L与泛酸盐（pantothenate）17μmol/L；

6. 培养液c：基础培养液为DMEM/Ham F12（1：1，V/V）混合培养液，加入NaHCO₃ 15mmol/L、HEPES 15mmol/L，pH7.4。再加入生物素33μmol/L与泛酸盐17μmol/L及100IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素；

7. ITT培养液：在培养液c的基础上添加胰岛素5μ g/ml、转铁蛋白10μg/ml和三碘甲腺原氨酸（T₃ ）200pmol/L；

8. 筛网：孔径为25μm的尼龙网筛。

实验方法：

1. 取材

① 取用普通食物喂养的4周龄雄性大鼠，乙醚麻醉后断头处死；

② 在无菌条件下从附睾周围切取脂肪垫，放入培养皿中。尽量除去血管。然后用清洗液冲洗3次；

2. 分离细胞

① 充分剪碎所取脂肪细胞。然后放入消化液中，37℃水浴中振荡消化40min；

② 将含有细胞和残余组织块的消化液倒入加有培养液a的烧杯中，用吸管反复吹打。然后通过孔径为25μ m的尼龙网筛。分别收集滤液和未滤过的组织块；

③ 将滤液以600g离心5min，弃上清液。在管中加入培养液b，制成SV细胞悬液，暂存入4℃冰箱中；

④ 合并两次制备所获的SV细胞悬液。用吸管吹打混匀。取少量SV细胞悬液，计数细胞。注意在计数时不要计入血细胞。根据需要调节细胞密度；

3. 原代培养

① 以10⁴ 个/cm² 的密度将细胞接种于培养皿中，加入培养液b。于37℃、3.5%CO₂ 培养箱中培养12—24h；

② 在细胞贴壁后，用培养液c清洗2次。然后加入培养液c过度培养1h；

③ 弃瓶中的培养液c，用PBS洗细胞2次；

④ 以后用ITT培养液维持培养。每3d换液一次。