正常大鼠前脂肪细胞的培养
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2029
实验材料:
1. 细胞来源:4周龄雄性Wistar或其它品系大鼠;
2. 清洗液:不含Ca2+ 和Mg2+ 的PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素,pH7.4;
3. 消化液:2mg/ml胶原酶溶液。用DMEM培养液配制,并加入牛血清白蛋白20mg/ml;
4. 培养液a:DMEM培养液,10%胎牛血清、100IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素;
5. 培养液b:在培养液a中补充生物素33μmol/L与泛酸盐(pantothenate)17μmol/L;
6. 培养液c:基础培养液为DMEM/Ham F12(1:1,V/V)混合培养液,加入NaHCO3 15mmol/L、HEPES 15mmol/L,pH7.4。再加入生物素33μmol/L与泛酸盐17μmol/L及100IU/ml青霉素、50μg/ml链霉素;
7. ITT培养液:在培养液c的基础上添加胰岛素5μ g/ml、转铁蛋白10μg/ml和三碘甲腺原氨酸(T3 )200pmol/L;
8. 筛网:孔径为25μm的尼龙网筛。
实验方法:
1. 取材
① 取用普通食物喂养的4周龄雄性大鼠,乙醚麻醉后断头处死;
② 在无菌条件下从附睾周围切取脂肪垫,放入培养皿中。尽量除去血管。然后用清洗液冲洗3次;
2. 分离细胞
① 充分剪碎所取脂肪细胞。然后放入消化液中,37℃水浴中振荡消化40min;
② 将含有细胞和残余组织块的消化液倒入加有培养液a的烧杯中,用吸管反复吹打。然后通过孔径为25μ m的尼龙网筛。分别收集滤液和未滤过的组织块;
③ 将滤液以600g离心5min,弃上清液。在管中加入培养液b,制成SV细胞悬液,暂存入4℃冰箱中;
④ 合并两次制备所获的SV细胞悬液。用吸管吹打混匀。取少量SV细胞悬液,计数细胞。注意在计数时不要计入血细胞。根据需要调节细胞密度;
3. 原代培养
① 以104 个/cm2 的密度将细胞接种于培养皿中,加入培养液b。于37℃、3.5%CO2 培养箱中培养12—24h;
② 在细胞贴壁后,用培养液c清洗2次。然后加入培养液c过度培养1h;
③ 弃瓶中的培养液c,用PBS洗细胞2次;
④ 以后用ITT培养液维持培养。每3d换液一次。