PCR产物的直接纯化原理、材料与方法

一．原理

PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。本实验中，Buffer PCR-A促使大于100bp的DNA片断选择性地吸附到silica膜上。经Buffer W1、Buffer W2洗涤去除残留在silica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料或放射性同位素标记的单核苷酸后，吸附到silica膜上的 DNA片断经微量水或Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学的操作。

二．材料与方法

1 材料

PCR产物

2 仪器、用具

恒温孵育器（65℃）、离心机、移液器、1.5ml 离心管

3 试剂

Buffer PCR-A；Buffer W1；已加无水乙醇的Buffer W2；Eluent或去离子水

4 方法

(1) 在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer PCR-A，若需加入的Buffer PCR-A不足100μl，则加入100μl。

(2) 将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步骤⑴中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm离心1min。

(3) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl Buffer W1，5500rpm离心1min。

(4) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube 中，加入700μl 已加无水乙醇的Buffer W2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。

(5) 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm离心1min。

(6) 连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30μl Eluent或去离子水（65℃预热）。

(7) 室温静置2min，14000rpm离心1min洗脱DNA。

(8) 取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。