推荐：PCR产物的直接测序

凝胶纯化PCR扩增的靶序列

如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可采用新的寡核苷酸重新进 行扩增，或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物，而后再各自重新扩增进行序列分析。 长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离:

1.片段大小在80-100bp时，可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来 分离。

2.从胶上切下含所南非PCR片段的薄片。

3.加入50∽100μlTE浸泡胶片，可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出 来。

4.取少量(1-5%)进行第二次扩增，为得到纯净单一的产物，用于第二次PCR扩增 的凝胶抽提物的量必须少于1ng。

5.现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而，如需重新扩增供Tab聚合 酶测序用的片段，最好用丙烯酰胺电泳分离。

当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时，如来自几个新近复制的基因，或 重复序列或保守的信号序列(conserved signal sequences)的同样显子，可以通过下 列两种不同方法来改进电泳分离。1).先用只切割某一模板的内切酶进行酶切，而后 电泳纯化完整的PCR产物。2).用可使核苷酸序列不同的扩增产物分开的电泳系统。下 一个部份将讨论此类系统中的变性甲酰胺梯度凝胶系统。采用方法一时，必须事先了 解在不同PCR产物中的内切酶位点。

杂合体的直接测序

当两个等位基因由于单一位点突变而产生差异时，用一个PCR引物直接进行测 序，能找出杂合位点。但是，带有几个点突变或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一来直接测序，将产生复合序列带(compound sequencing ladders)。有四种 方法可以确定几种点突在型并从杂合体中获得单个等位基因的序列:1).克隆分离不同 的模板;2).在测序之前，利用模板之间核苷酸序列的差异，用电泳技术分离不同的模 板;3).在测序反应中只启动一个等位基因;4).只扩增一个等位基因。

测序模板的制备

与PCR产物的直接测序有关的一些问题是变性后由于扩增片段的两条链可以迅速 结合起来，从而阻止了测序引物与它的互补序列退火，或阻止了引物──模板复合物 的延伸。在测序反应中，模板链重新结合使一小部份模析骖与测序从而弱化最终的测 序条带。为减少此问题，可用改进的标准双链DNA测序法或用PCR制备单链模板。