PCR产物常规纯化方法
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目的
探索一种方法,能将PCR产物大批量地、廉价地、纯度比较高地纯化出来,并且最好能去掉200 bp 以下的小片段DNA,用于DNA测序。
有文献和方法说,不同浓度的PEG能沉淀不同长度的DNA,所以,先做了一下不同PEG浓度对DNA沉淀的作用,见下图,标本是用的50bp DNA Marker,上一行Marker溶解在纯水里面的,下一行Marker溶解在模拟的PCR反应体系里面的(除了没加Taq,其他与常规PCR一致),此目的是验证一下PCR体系里面的盐离子对PEG沉淀是否有影响。
总起来,结果还比较满意,可以看到,PEG浓度越高,能沉淀出来的DNA片段越小,并且,PCR反应体系里面的盐离子对PEG沉淀影响似乎不大,我测序的标本都在300bp以上,所以,最终选择的PEG浓度为12%。
方法
96孔PCR板操作。
1. 20μLPCR产物加入5 μL 5M的NaCl(终浓度0.5 M)。
2. 加入25 μL 24%的PEG8000溶液(终浓度12%);混匀。
3. 4度放置30 min。
4. 4500 g,4℃离心30 min 后,立即将板反扣在厚的吸水纸上,离心至150 g,去除上清。
5. 加入70 μL 75%EtOH,4500 g,4℃离心15 min,立即再板反扣在厚的吸水纸上,离心至150 g,去除上清;重复一次。
6. 50℃或室温干燥,加入10 μL ddH2O溶解,即为纯化的PCR产物,测序时取1 μL 做模板。
讨论
1、此方法能直接用96孔PCR板操作,能大批量纯化PCR产物,并且,纯度较高,可以去掉300 bp 以下的PCR非特意产物。曾经用96孔板,用传统的酒精醋酸钠沉淀纯化过PCR产物,可惜非特意扩增产物、引物二聚体和没有消耗完的引物都纯化出来了,对测序造成严重的干扰。
2、此方法纯化的成本很低,PEG8000、NaCl、酒精,差不多是实验室常规试剂,比96孔板纯化kit要便宜多得多,另外的突出的优点是能将200 bp 以下的片段去掉,我的一批标本有一个180 bp 的非特异产物,用此方法很方便的去掉了,测序结果很不错。
3、此方法有一点不好处,就是得率较低,大家可以比较下图,左边的Marker加了1 μg,其他标本是2 μg 的Marker纯化后的所有产物,纯化得率也就是30%。好在测序不需要很多DNA,对测序来说,已经足够了