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PEG 沉淀 PCR 产物的方法

丁香实验

2523

最近,摸索了一下 PEG 沉淀 PCR 产物的方法,贴出来,与大家共享。摸索这个方法的目的主要是,探索一种方法,能将 PCR 产物大批量地、廉价地、纯度比较高地纯化出来,并且最好能去掉 200bp 以下的小片段 DNA,用于 DNA 测序。

有文献和方法说,不同浓度的 PEG 能沉淀不同长度的 DNA,所以,先做了一下不同 PEG 浓度对 DNA 沉淀的作用,见下图,标本是用的 50bp DNA Marker,上一行 Marker 溶解在纯水里面的,下一行 Marker 溶解在模拟的 PCR 反应体系里面的(除了没加 Taq,其他与常规 PCR 一致),此目的是验证一下 PCR 体系里面的盐离子对 PEG 沉淀是否有影响。

总起来,结果还比较满意,可以看到,PEG 浓度越高,能沉淀出来的 DNA 片段越小,并且,PCR 反应体系里面的盐离子对 PEG 沉淀影响似乎不大,我测序的标本都在 300bp 以上,所以,最终选择的 PEG 浓度为12%。

方法:96 孔 PCR 板操作

1、20μLPCR 产物加入 5μL 5M 的 NaCl(终浓度 0.5M);

2、加入 25μL 24% 的 PEG8000 溶液(终浓度 12%);混匀;

3、4 度放置 30min;

4、4500xg,4 度离心 30min 后,立即将板反扣在厚的吸水纸上,离心至 150xg,去除上清;

5、加入 70μL 75%EtOH,4500xg,4 度离心 15min,立即再板反扣在厚的吸水纸上,离心至 150xg,去除上清;重复一次;

6、50 度或室温干燥,加入 10μL ddH2O 溶解,即为纯化的 PCR 产物,测序时取 1μL 做模板。


讨论:

1、此方法能直接用 96 孔 PCR 板操作,能大批量纯化 PCR 产物,并且,纯度较高,可以去掉 300bp 以下的 PCR 非特意产物。曾经用 96 孔板,用传统的酒精醋酸钠沉淀纯化过 PCR 产物,可惜非特意扩增产物、引物二聚体和没有消耗完的引物都纯化出来了,对测序造成严重的干扰。


2、此方法纯化的成本很低,PEG8000、NaCl、酒精,差不多是实验室常规试剂,比 96 孔板纯化 kit 要便宜多得多,另外的突出的优点是能将 200bp 以下的片段去掉,我的一批标本有一个 180bp 的非特异产物,用此方法很方便的去掉了,测序结果很不错。


3、此方法有一点不好处,就是得率较低,大家可以比较下图,左边的 Marker 加了 1μg,其他标本是 2μg 的 Marker 纯化后的所有产物,纯化得率也就是 30%。好在测序不需要很多 DNA,对测序来说,已经足够了。

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