【共享】大批量、廉价、用于测序的PCR产物纯化方法--PEG沉淀
丁香园论坛
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最近，摸索了一下PEG沉淀PCR产物的方法，贴出来，与大家共享。
摸索这个方法的目的主要是，探索一种方法，能将PCR产物大批量地、廉价地、纯度比较高地纯化出来，并且最好能去掉200bp以下的小片段DNA，用于DNA测序。
有文献和方法说，不同浓度的PEG能沉淀不同长度的DNA，所以，先做了一下不同PEG浓度对DNA沉淀的作用，见下图，标本是用的50bp DNA Marker，上一行Marker溶解在纯水里面的，下一行Marker溶解在模拟的PCR反应体系里面的（除了没加Taq，其他与常规PCR一致），此目的是验证一下PCR体系里面的盐离子对PEG沉淀是否有影响。
总起来，结果还比较满意，可以看到，PEG浓度越高，能沉淀出来的DNA片段越小，并且，PCR反应体系里面的盐离子对PEG沉淀影响似乎不大，我测序的标本都在300bp以上，所以，最终选择的PEG浓度为12％。
方法： 96孔PCR板操作。
1、20μLPCR产物加入5μL 5M的NaCl（终浓度0.5M）；
2、加入25μL 24％的PEG8000溶液（终浓度12％）；混匀；
3、4度放置30min；
4、4500xg，4度离心30min后，立即将板反扣在厚的吸水纸上，离心至150xg，去除上清；
5、加入70μL 75％EtOH，4500xg，4度离心15min，立即再板反扣在厚的吸水纸上，离心至150xg，去除上清；重复一次；
6、50度或室温干燥，加入10μL ddH2O溶解，即为纯化的PCR产物，测序时取1μL做模板。
讨论：
1、此方法能直接用96孔PCR板操作，能大批量纯化PCR产物，并且，纯度较高，可以去掉300bp以下的PCR非特意产物。曾经用96孔板，用传统的酒精醋酸钠沉淀纯化过PCR产物，可惜非特意扩增产物、引物二聚体和没有消耗完的引物都纯化出来了，对测序造成严重的干扰。
2、此方法纯化的成本很低，PEG8000、NaCl、酒精，差不多是实验室常规试剂，比96孔板纯化kit要便宜多得多，另外的突出的优点是能将200bp以下的片段去掉，我的一批标本有一个180bp的非特异产物，用此方法很方便的去掉了，测序结果很不错。
3、此方法有一点不好处，就是得率较低，大家可以比较下图，左边的Marker加了1μg，其他标本是2μg的Marker纯化后的所有产物，纯化得率也就是30%。好在测序不需要很多DNA，对测序来说，已经足够了。
摸索这个方法的目的主要是，探索一种方法，能将PCR产物大批量地、廉价地、纯度比较高地纯化出来，并且最好能去掉200bp以下的小片段DNA，用于DNA测序。
有文献和方法说，不同浓度的PEG能沉淀不同长度的DNA，所以，先做了一下不同PEG浓度对DNA沉淀的作用，见下图，标本是用的50bp DNA Marker，上一行Marker溶解在纯水里面的，下一行Marker溶解在模拟的PCR反应体系里面的（除了没加Taq，其他与常规PCR一致），此目的是验证一下PCR体系里面的盐离子对PEG沉淀是否有影响。
总起来，结果还比较满意，可以看到，PEG浓度越高，能沉淀出来的DNA片段越小，并且，PCR反应体系里面的盐离子对PEG沉淀影响似乎不大，我测序的标本都在300bp以上，所以，最终选择的PEG浓度为12％。
方法： 96孔PCR板操作。
1、20μLPCR产物加入5μL 5M的NaCl（终浓度0.5M）；
2、加入25μL 24％的PEG8000溶液（终浓度12％）；混匀；
3、4度放置30min；
4、4500xg，4度离心30min后，立即将板反扣在厚的吸水纸上，离心至150xg，去除上清；
5、加入70μL 75％EtOH，4500xg，4度离心15min，立即再板反扣在厚的吸水纸上，离心至150xg，去除上清；重复一次；
6、50度或室温干燥，加入10μL ddH2O溶解，即为纯化的PCR产物，测序时取1μL做模板。
讨论：
1、此方法能直接用96孔PCR板操作，能大批量纯化PCR产物，并且，纯度较高，可以去掉300bp以下的PCR非特意产物。曾经用96孔板，用传统的酒精醋酸钠沉淀纯化过PCR产物，可惜非特意扩增产物、引物二聚体和没有消耗完的引物都纯化出来了，对测序造成严重的干扰。
2、此方法纯化的成本很低，PEG8000、NaCl、酒精，差不多是实验室常规试剂，比96孔板纯化kit要便宜多得多，另外的突出的优点是能将200bp以下的片段去掉，我的一批标本有一个180bp的非特异产物，用此方法很方便的去掉了，测序结果很不错。
3、此方法有一点不好处，就是得率较低，大家可以比较下图，左边的Marker加了1μg，其他标本是2μg的Marker纯化后的所有产物，纯化得率也就是30%。好在测序不需要很多DNA，对测序来说，已经足够了。
