噬菌体的分离与纯化

一、目的要求

1. 学习分离、纯化噬菌体的基本原理和方法。

2. 观察噬菌斑。

二、基本原理

因为噬菌体是专性寄生物，所以自然界中凡有细菌分布的地方，均可发现其特异的噬菌体的存在，亦即噬菌体是伴随着宿主细菌的分布而分布的，例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，故也能很容易地分离到大肠杆菌噬菌体；乳牛场有较多的乳酸杆菌，也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。

由于噬菌体侵入细菌细胞后进行复制而导致细胞裂解，噬菌体即从中释放出来，所以

(a)在液体培养基内可使混浊的菌悬液变为澄清，此现象可指示有噬菌体存在；也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而可分离到特异的噬菌体；

(b)在有宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌而形成透明的空斑，称噬菌斑（图Ⅻ-1），一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体的效价。

本实验是从阴沟污水中分离大肠杆菌噬菌体，刚分离出的噬菌体常不纯，如表现在噬菌斑的形态、大小不一致等，然后再作进一步纯化。

三、器材

37 ℃培养18小时的大肠杆菌斜面，阴沟污水；

本次实验均用普通肉膏蛋白胨培养基500 ml三角烧瓶内装三倍浓缩的液体培养基100 ml，试管液体培养基，琼脂平板，上层琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管4 ml），底层琼脂平板（含培养基10 ml，琼脂2%）。

灭菌吸管，灭菌玻璃涂布器，灭菌蔡氏细菌滤器，灭菌抽滤瓶，恒温水浴箱，真空泵等。

四、操作步骤

1. 噬菌体的分离

(1)制备菌悬液 取大肠杆菌斜面一支，加4 ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。

(2)增殖培养于100 ml三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中，加入污水样品200 ml与大肠杆菌悬液2 ml，37 ℃培养12—24小时。

(3)制备裂解液 将以上混合培养液2500 r/min离心15分钟。

将已灭菌的蔡氏过滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，用橡皮管连接抽滤瓶与安全瓶，安全瓶再连接于真空泵（如图Ⅻ-2）。图上的真空表接或不接均可。

将离心上清液倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液倒入灭菌三角烧瓶内，37 ℃培养过夜，以作无菌检查。

(4)确证试验 经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证实噬菌体的存在。

(a)于肉膏蛋白胨琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。

(b)待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，置37 ℃培养过夜。如果在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。

2. 噬菌体的纯化

(1)如已证明确有噬菌体存在，则用接种环取滤液一环接种于液体培养基内，再加入0.1 ml大肠杆菌悬液，使混和。

(2)取上层琼脂培养基，溶化并冷却至 48 ℃（可预先溶化、冷却，放48 ℃水浴箱内备用），加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2 ml，立即混匀。

(3)并立即倒入底层培养基上，铺匀。置37 ℃培养24小时。

(4)此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内， 37 ℃培养。

(5)待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。

（以上(1)(2)(3)三步骤，目的是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量，最好在做无菌试验的同时，由教师先做预备试验，若平板上的噬菌斑连成一片，则需减少接种量（少于一环）或增加液体培养基的量；若噬菌斑太少，则增加接种量。以免全班同学重做）。

3. 高效价噬菌体的制备

刚分离纯化所得到的噬菌体往往效价不高，需要进行增殖。

将纯化了的噬菌体滤液与液体培养基按1∶10的比例混合，再加入大肠杆菌悬液适量（可与噬菌体滤液等量或1/2的量），培养，使增殖，如此重复移种数次，最后过滤，可得到高效价的噬菌体制品。

五、实验报告

绘图表示平板上出现的噬菌斑。