SDS法提取植物基因组DNA操作程序
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【实验目的】
学习和掌握常用基因组DNA提取方法。
【实验要求】
1.设计所采用实验方案并独立完成所有实验操作;
2.获得高纯度、完整DNA样品。
一、原理:
利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度(55—65℃)条件下裂解植物细胞,使染色体离析,蛋白质变性,释放出核酸,然后提高盐浓度(KAc)和降低温度(冰上保温)的办法沉淀除去蛋白质和多糖(在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物),离心除去沉淀后,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
二、药品试剂及耗材:
---- 20% SDS ph7.2
---- 5 mol/L KAc
---- 氯仿:异戊醇(24:1)
—— 异丙醇
—— 70%乙醇
—— TE缓冲液 :10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,PH8.0
耗材:
移液枪,15、2.0、1.5ml离心管,篮、黄、白枪头各四套离心管架4个,离心管盒2个,水浴泡沫8个,研钵及小药勺8套
棉手套,薄膜手套,透明胶布,剪刀
三、操作程序
1. 将1 g植物材料于液氮速冻,然后在研钵中将其磨碎,将粉末转至2 ml离心管中。
2. 加入1.2 ml预热至65℃的提取缓冲液(3V),轻缓振荡混匀,加入120μl 20%SDS(达到终浓度2%),混匀,置65℃水浴中放置30分钟,不时颠倒混匀。
3. 加入0.45 ml 5M的醋酸钾(1/10V),混匀,冰浴20分钟,在10000 rpm离心20 min。需要的话,Miracloth纱布过滤除去沉淀,取上清液转入另一离心管中。
4. 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀, 12000 rpm离心15 min。
5. 转移上清液到另一新离心管中,加入0.7V冰预冷异丙醇,轻轻颠倒混匀,(见丝状沉淀)-20℃放置30分钟沉淀核酸。
6. 25℃,12000 rpm,离心10 min,收集沉淀。
7. 弃上清,70%乙醇洗两次。