用siRNA沉默基因

RNAi 在基础研究领域和医学研究领域的应用，其基础是 siRNA 的基因沉默作用。目前在体内或体外 RNAi 中应用的 siRNA 主要有两类： RNA 和 DNA 载体。

1 、 RNA

（ 1 ） siRNA ：化学合成或体外转录的方法得到 ~21nt 的两段小 RNA ，经退火后形成 ~19 个碱基互补，两边 3? 端各有 2 个碱基突出的 siRNA 。目前此类 siRNA 应用最广泛。尤其是经过修饰后提高稳定性的 siRNA 仍可表现特异的基因沉默作用，为其在体内的应用提供了可能的前景。

（ 2 ） esiRNA ：因为上述的 siRNA 基因抑制的有效性关键在于靶基因序列片段的选择，但现在并不知道 mRNA 的哪一个部位对 siRNA 更敏感，所以根据靶基因 mRNA 设计的长 dsRNA 经 Dicer 剪切成一系列 ~21nt 的 siRNA －统称为 esiRNA ，可能更有效、更方便的抑制基因的表达。

（ 3 ）发夹 RNA ：根据 miRNA 设计的发夹 RNA ，或基于 siRNA 的发夹 RNA 在体内都表现出有效地基因抑制作用。

2 、 DNA 载体

由于在哺乳动物和果蝇中不存在 RNAi 的扩增机制，导入以上 RNA 产生的 RNAi 作用不可避免的具有瞬时性。为了克服这个弱点，一些研究小组发展了基于 DNA 载体在体内表达 siRNA 的技术。这种载体可以是质粒，也可以是病毒，甚至可以是 DNA 片段。

（ 1 ）基于 RNA 聚合酶 II 启动子的表达系统：在弱或无干扰素应答反应的组织或细胞中，可以构建长的发夹 RNA ，进一步由 Dicer 剪切成 siRNA 。这种表达系统的优点是允许组织或细胞特异性的 dsRNA 表达，但是绝大部分哺乳动物细胞对长的发夹 RNA 的干扰素应答而产生非特异作用，限制了此类表达系统的广泛应用。

（ 2 ）基于 RNA 聚合酶 III 启动子的表达系统：目前主要应用的是 U6 启动子和 H1 启动子，一方面它们在体内有较高的转录效率，另一方面以数个连续 T 为终止信号，限制了 RNA 的大小从而不引起干扰素的非特异作用。此种表达系统还可分成三类：一是基于发夹 RNA 的基因沉默效应而设计的表达发夹 RNA 的质粒载体；二是在载体上构建两个启动子分别表达 siRNA 的正义 RNA 和反义 RNA ；三是共同导入分别表达 siRNA 的互补片段的含有 U6 或 H1 启动子的 DNA 片段，或者表达发夹 RNA 的 DNA 片段。尤其是后者，可以用 PCR 方法方便的获得，大大扩展了其应用。