骨髓基质干细胞的分离与培养

骨髓基质干细胞(BMSC)是最常见的成体干细胞，其操作流程比较稳定和成熟。即以BMSC为例，初步阐述成体干细胞具体应用步骤与流程。

1.配制DMEM培养液

取DMEM培养基10g，NaHC03 2.2g，L-谷氨酰胺300mg，维生素C 37.5mg，青霉素10万单位，链霉素10万单位，加适量三蒸水充分溶解后，调节pH值至7.4，补三蒸水至900m1。经无菌0.22btm过滤器过滤后，加FBSl00ml，4℃保存。

2.配制胰蛋白酶-EDTA消化液

称取胰蛋白酶0.125g，EDTA 0.01 g，适量PBS充分溶解，调pH值至7.4，补三蒸水定容至100ml，0.22um过滤器过滤除菌，分装，4℃保存。

3.配制Percoll分离液

Percoll原液与1.5mol/LNaCl以9:1比例稀释。

4.配制成骨诱导培养液

DMEMlog/L，p-磷酸甘油钠10nmo/L，地塞米松10nmol/lL-a-磷酸抗坏血酸50btmol/L，L-谷氨酰胺300mg/L，l，25(OH)2-维生素D3 10nmol/L，10％胎牛血清。

5.配制成软骨细胞诱导培养液

DMEM 10g/L，地塞米松10 nmol/L，L-α-磷酸维生素C 50 umol/L，L谷氨酰胺300mg/L，TGF-βl 10ng/ml，IGFl00ug/ml，10％胎牛血清。

6.配制成脂肪细胞诱导液

DMEM 10g/L，10％FBS，1-甲基-3-异丁基黄嘌呤0.5mmol/m1，地塞米松1mmol/m1，胰岛素10ug/m1，吲哚美辛100mmol/m1。

1.人骨髓的抽取

成年志愿者应无系统性疾病，年龄最好在20～40岁之间。所用器械预先用肝素润湿，10m1注射器吸人1ml肝素化PBS(1 000U/ml)。骨髓提供者仰卧位，髂前上棘常规消毒、铺巾，用2％利多卡因局部浸润麻醉，骨髓穿刺针垂直进入骨髓腔中，缓慢抽取2m1骨髓，立即注入15ml离心管中(如需骨髓量多，必须重新更换穿刺点，防止外周血造成骨髓稀释)。动物的骨髓穿刺过程基本相似。

2.BMSC的分离

采用密度梯度离心法。骨髓以24号注射针头反复吹打成单细胞悬液，600g离心5min，小心吸去上层悬浮脂肪。离心管中预置Percoll分离液，Percoll原液比重1.13g/m1，用0.9％生理盐水调整至密度1.073g/m1。注意将骨髓沿管壁缓慢滴加入Percoll液面上，两者(骨髓：Percoll)体积为l：2；900g离心30min。可见离心管中液体分为5层，毛细吸管吸取percoll层上云雾状有核细胞层，加入PBSloml，600g离心15rain，弃上清液获取有核细胞，细胞计数。以lXl0’/cm2密度接种于培养皿，加入10 m1低糖DMEM培养液，37℃,叵温，在5％C O2 、95％O2 混合气体环境中培养。

3.BMSC原代培养

原代细胞接种后，每天倒置显微镜观察细胞贴壁情况，根据细胞贴壁情况，于接种后2～5天换液。换液时先轻轻摇动培养皿，使未贴壁的红细胞浮起，吸除含大量红细胞的培养液，PBS洗涤2～3次。此时在低倍镜下可清楚地见到多个克隆形成，加入新鲜培养液，继续在相同的条件下培养。原代细胞一般于7～14天达到80％融合，传代培养。

4.BMSC消化传代

吸去培养液，加入PBS 10 m1，清洗2遍；吸尽PBS后加入0.25％胰蛋白酶-EDTA4m1，37~C放置2rain；待细胞变圆形浮起，加人含血清的培养液4m1，终止消化。收集细胞到离心管内，l 500r/min离心5min，吸去上清液；加入10mlPBS，漩涡振荡器内混匀，台盼蓝染色观察软骨细胞活力，血细胞计数板计数。以4X10’/cm2接种到10cm培养皿培养，加入10ml培养液，37~C恒温培养。

5.BMSC多向诱导实验

传代培养时分别采用以上配制的成骨、成软骨细胞、成脂肪细胞诱导液培养，倒置显微镜观察细胞形态，培养皿底部预置玻片用于检测。对照组仍用含10％FBS的DMEM培养液培养与传代，与诱导组同期传代，同期观察。