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骨髓基质干细胞的分离与培养

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骨髓基质干细胞的分离与培养
骨髓基质干细胞(BMSC)是最常见的成体干细胞,其操作流程比较稳定和成熟。即以BMSC为例,初步阐述成体干细胞具体应用步骤与流程。

(一)骨髓基质干细胞分离培养的准备工作

1.配制DMEM培养液
取DMEM培养基10g,NaHC03 2.2g,L-谷氨酰胺300mg,维生素C 37.5mg,青霉素10万单位,链霉素10万单位,加适量三蒸水充分溶解后,调节pH值至7.4,补三蒸水至900m1。经无菌0.22btm过滤器过滤后,加FBSl00ml,4℃保存。

2.配制胰蛋白酶-EDTA消化液
称取胰蛋白酶0.125g,EDTA 0.01 g,适量PBS充分溶解,调pH值至7.4,补三蒸水定容至100ml,0.22um过滤器过滤除菌,分装,4℃保存。

3.配制Percoll分离液
Percoll原液与1.5mol/LNaCl以9:1比例稀释。

4.配制成骨诱导培养液
DMEMlog/L,p-磷酸甘油钠10nmo/L,地塞米松10nmol/lL-a-磷酸抗坏血酸50btmol/L,L-谷氨酰胺300mg/L,l,25(OH)2-维生素D3 10nmol/L,10%胎牛血清。

5.配制成软骨细胞诱导培养液
DMEM 10g/L,地塞米松10 nmol/L,L-α-磷酸维生素C 50 umol/L,L谷氨酰胺300mg/L,TGF-βl 10ng/ml,IGFl00ug/ml,10%胎牛血清。

6.配制成脂肪细胞诱导液
DMEM 10g/L,10%FBS,1-甲基-3-异丁基黄嘌呤0.5mmol/m1,地塞米松1mmol/m1,胰岛素10ug/m1,吲哚美辛100mmol/m1。

(二)骨髓基质干细胞的分离与培养

1.人骨髓的抽取
成年志愿者应无系统性疾病,年龄最好在20~40岁之间。所用器械预先用肝素润湿,10m1注射器吸人1ml肝素化PBS(1 000U/ml)。骨髓提供者仰卧位,髂前上棘常规消毒、铺巾,用2%利多卡因局部浸润麻醉,骨髓穿刺针垂直进入骨髓腔中,缓慢抽取2m1骨髓,立即注入15ml离心管中(如需骨髓量多,必须重新更换穿刺点,防止外周血造成骨髓稀释)。动物的骨髓穿刺过程基本相似。

2.BMSC的分离
采用密度梯度离心法。骨髓以24号注射针头反复吹打成单细胞悬液,600g离心5min,小心吸去上层悬浮脂肪。离心管中预置Percoll分离液,Percoll原液比重1.13g/m1,用0.9%生理盐水调整至密度1.073g/m1。注意将骨髓沿管壁缓慢滴加入Percoll液面上,两者(骨髓:Percoll)体积为l:2;900g离心30min。可见离心管中液体分为5层,毛细吸管吸取percoll层上云雾状有核细胞层,加入PBSloml,600g离心15rain,弃上清液获取有核细胞,细胞计数。以lXl0’/cm2密度接种于培养皿,加入10 m1低糖DMEM培养液,37℃,叵温,在5%C O2 、95%O2 混合气体环境中培养。

3.BMSC原代培养
原代细胞接种后,每天倒置显微镜观察细胞贴壁情况,根据细胞贴壁情况,于接种后2~5天换液。换液时先轻轻摇动培养皿,使未贴壁的红细胞浮起,吸除含大量红细胞的培养液,PBS洗涤2~3次。此时在低倍镜下可清楚地见到多个克隆形成,加入新鲜培养液,继续在相同的条件下培养。原代细胞一般于7~14天达到80%融合,传代培养。

4.BMSC消化传代
吸去培养液,加入PBS 10 m1,清洗2遍;吸尽PBS后加入0.25%胰蛋白酶-EDTA4m1,37~C放置2rain;待细胞变圆形浮起,加人含血清的培养液4m1,终止消化。收集细胞到离心管内,l 500r/min离心5min,吸去上清液;加入10mlPBS,漩涡振荡器内混匀,台盼蓝染色观察软骨细胞活力,血细胞计数板计数。以4X10’/cm2接种到10cm培养皿培养,加入10ml培养液,37~C恒温培养。

5.BMSC多向诱导实验
传代培养时分别采用以上配制的成骨、成软骨细胞、成脂肪细胞诱导液培养,倒置显微镜观察细胞形态,培养皿底部预置玻片用于检测。对照组仍用含10%FBS的DMEM培养液培养与传代,与诱导组同期传代,同期观察。

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