技术贴：抗体药物下游工艺解决方案

GE医疗生命科学2015-09-17

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单克隆抗体

单克隆抗体药物一直都是免疫治疗的热点，也成为医药巨头竞争的前沿阵地。

1997 年：FDA 批准的针对 CD20 的利妥昔单抗。

80 年代后期：针对 HER2，CD52，EGFR 和 VEGFR 的单抗每个都是重磅炸弹。

2013 年：从肿瘤药销售额前20名来看（如下图），前三名重磅炸弹均来自于单克隆抗体药物。而针对肿瘤免疫疗法 BMS 的Yervoy 自 2011 年上市以来成为后起之秀，也标志着癌症免疫疗法的开端。

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癌症免疫疗法被各大顶级学术杂志评为最佳科学突破，被视为癌症治疗药物的第三次革命。免疫疗法靶点是正常免疫细胞，激活人体自身的免疫系统来治疗癌症。具有代表性的肿瘤免疫治疗是以 PD1 靶点的药物。

PD-1

PD-1（Programed death-1），程序性死亡受体，位于正常免疫T细胞表面，是一种重要的免疫抑制分子，由日本京都大学本庶佑教授于 1992 年发现。2013 年同样靶点 PD1 的两个新药物，施贵宝的 nivolumab (商品名：Opdivo)和默沙东的pembrolizumab(商品名：Keytruda)，发布了令人震惊的临床效果：在所有已有治疗方案都失效的黑色素癌晚期病人(多数癌症已经转移)身上，这两个药物让 60% 以上的病人肿瘤减小乃至消失了超过 2 年，标志着免疫疗法取得突破性进展。

PD-1 市场规模：BMS 与默克、罗氏和其他公司争相申请 FDA 批准，除此之外，GSK、阿斯利康、辉瑞以及诺华等医药巨头纷纷加入肿瘤免疫治疗的大军之中。PD-1 及类似靶点市场的最大份额预计将达到 350 亿美元一年。

我国情况：在我国，针对癌症免疫疗法的抗体药物研发也已经热潮涌动。2015 年卫计委重大新药创制专项，明确将 PD-1、PD-L1及 CTLA-4 列为重要靶点。申报名单中，中美华世通、中山康方、上海君实、四川大学、复旦大学，目前都还在临床前。名单之外的百济神州，恒瑞以及中信国健也已经在临床前或者临床阶段。

「了解下游层析处理的关键」

1、什么下游层析处理的关键?

用于肿瘤靶向治疗以及类似以 PD1 类作为靶点的免疫治疗抗体药物作为一种高剂量使用的生物制剂，对产品纯度以及杂质残留量（宿主蛋白 HCP，核酸，内毒素，聚集体，ProteinA 残留等）要求非常严格。尤其是生物类似药，还要保持与原研药一致的生物学特性（酸碱峰比例）和等效的药物功能。在抗体药物市场竞争激烈的情况下，如何快速获得抗体的纯化产品以及优化其生产工艺，缩短产品生产周期，降低生产成本和提高生产效率，以加速推动产品上市和提高竞争力，成为各抗体药物研发公司关注的焦点。另外在膨胀的市场需求下，抗体类药物上游的发酵体积也越来越大，表达量越来越高，同时产品要求也越来越高，随之而来是下游的纯化压力。如何选择高载量，高分辨率介质增加处理体积和通量，增加分离纯化效果则是下游层析处理时需要考虑的首要问题。

2、如何选择亲和填料？

从 2007 年至今，随着 GE 医疗出品的耐碱亲和填料 Mabselect SuRe和Mabselect SuRe LX，多模式填料 Adhere 以及 MMC，以及兼顾高载量，高分辨率的阳离子填料 Capto S ImpAct 填料的推出，GE 医疗在抗体领域形成了全面，成熟以及高效的纯化工艺 Toolbox 组合（见下图）。

GE医疗的抗体纯化Toolbox图

3、亲和填料耐碱为何重要？

根据 QbD 理念，产品质量归结于生产过程的设计和控制。而在抗体的生产纯化过程中，如何做到有效的清洗以避免细菌，内毒素以及病毒的污染是至关重要的。一般 0.1-1M NaOH 可以有效的对系统以及层析介质进行在位清洗，可以有效的防止因清洗不彻底导致产品的交叉污染现象。GE 医疗拥有独家专利改造后的耐碱填料 Mabselect SuRe 可耐受 0.1M NaOH【1】，尤其是Mabselect SuRe LX 可耐受高达 0.5M 的 NaOH 进行在位清洗，同时保持较长的使用寿命，为工业抗体客户带来了极大的便利以及减少了生产成本。NaOH 碱清洗与其他方式清洗层析纯化介质的效果对比见下图：

使用盐酸胍以及0.1M NaOH处理填料的效果对比图

4、GE 亲和填料 Mabselect SuRE LX 的显著优势是？

相较于其他亲和填料，GE的Mabselect SuRe LX 是在 Mabselect SuRe 的基础上，显著提高了对抗体的结合载量（平均动态结合载量 DBC 约 60g/L），且一如继往地保持其洗脱产物的纯度和高回收率，同时它也是市面上唯一可耐受高达 0.5M NaOH 清洗且可以有较长使用寿命（150 个 Cycle 依然保留 80% 动态载量）。若在 0.1M NaOH 清洗的情况下，300 个 Cycle 保持 95% 以上的动态载量，显著的使用寿命大大降低了生产成本，同时可以耐受 0.5M NaOH 进行清洗，大大减少样品间的交叉污染几率以及提高清洗的效率。而这最新一代的耐碱，高载量的亲和填料 Mabselect SuRe LX 也已经成功的应用于抗体药物研发纯化工艺中。

在抗体的纯化工艺 Toolbox 中，不管是两步法还是三步法，都是以 Mabselect SuRe 或者 Mabselect SuRe LX 作为亲和的基础上实现，除了亲和步骤之外，不同的工艺组合可以解决的问题。具体每种工艺组合发挥的显著功能详述如下：

（1）Adhere 多模式填料——实现两步法抗体层析工艺

Capto Adhere 介质为复合多模式填料，其配基含有阴离子交换，氢键和疏水性质，对于抗体的聚集体有非常独特而高效的去除能力，此外通过有效的实验设计（DoE），还可以起到有效去除脱落的Protein A 配基，宿主蛋白（HCP），核酸，内毒素以及潜在的病毒，且通过流穿模式时，Capto Adhere 载量可达 100-200mg/ml，将 Mabselect SuRe LX 和 Capto Adhere 相结合，仅用两步层析纯化，就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高生产效率，同时增加了收率，降低生产成本。

Capto Adhere ImpRes 为更小粒径的填料，可以提供更高分辨率，所以一方面与 Capto Adhere 同样以流穿的模式，与 Mabselect SuRe LX 组合形成两步法层析工艺；另外一方面也可以使抗体走结合的模式，充分利用其高分辨率的优势，同时达到去除聚集体的效果，形成两步法层析工艺。

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全析因DoE设计模型设计Capto Adhere ImpRes纯化步骤以及DoE分析结果ss

（2）经典三步法——抗体纯化组合再添新成员

经典版的抗体三步法纯化工艺一直是抗体下游应用最多的组合，可以帮助大部分抗体客户快速的建立抗体的纯化生产工艺，加快产品的上市周期以及在激烈的竞争中分享市场快速发展带来的利益。

随着 2014 年高载量及高分辨率的 Capto S ImpAct 的上市，使得经典三步法抗体纯化流程中阳离子步骤除了高分辨率的 Capto SP ImpRes 之外多了一种选择，二者均可以有效的去除聚集体，宿主蛋白以及脱落的 Protein A 配基。此外 Capto S ImpAct 对于抗体的载量可高达 120mg/ml, 可大大节省了下游的纯化成本。

（3）多模式填料——抗体纯化中的应用优势

从以上抗体纯化的 Toolbox 组合中，可看到多模式填料的广泛应用，相较于传统单一的阴阳离子交换填料，多模式填料（Adhere以及MMC）在配基中添加了苯环以及氢键效应，使得这两款填料在使用中可以耐受样品较高的盐浓度（150mM）而不明显影响填料对样品的载量，同时也可以利用配基中苯环疏水性能，对抗体及其电荷异构体，聚集体和降解带等达到较好的分离效果。

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