淋巴细胞分离的关键点

【求助】淋巴细胞分离

参与者：zhangwenli

请教：我现在在做实验，第一步就是取健康人的外周血5ml，分离出里面的淋巴细胞.可是做了好几次都没能把它给分离出来.最后一次，我吸取了白雾状的一层，离心后看不到红色沉淀，结果放在高倍显微镜下一看，绝大部分还是红细胞，里面的淋巴细胞少得可怜.我是按照步骤一步一步的做了，怎么还是把淋巴细胞分离不出来呢?从血中分离淋巴细胞究竟需要注意什么?关键在什么地方? 急~~~

参与者：变变鱼

1.淋巴细胞分离液的使用要求是什么?有的需要稀释全血.

2.带出红细胞是难免的，对以后实验影响大吗

参与者：pwqbq

你是直接分离淋巴细胞还是分离PBMC后再贴壁获得淋巴细胞啊，我们是拿Ficoll分离出单个核细胞后在贴壁获得淋巴细胞，说说分离PBMC的心得吧，也许对你有用，分离液和整个分离过程一定要在室温下使用，18~25度吧，全血稀释一倍后再分，2000转20min，再1000转10min洗两遍就差不多了。分离外周血带出的红细胞应该不是很多，脐带血的话是比较多一些，不过影响不大，你计数的时候可用3%的冰醋酸稀释计数，这样可以破坏红细胞，数的时候就不用担心受到红细胞的影响了。

参与者：zhangwenli

我也是按照你所说的步骤做的，全血稀释一倍后再分离.可是得到的PBMC加入含百分之十的小牛血清的1640中，在显微镜下看，视野里几乎全是红细胞，淋巴细胞太少了.不知是哪里出了问题~`

参与者：liu2050

淋巴细胞分离液，用法：>；

1．抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温中，水平离心500×g 20分钟。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又成为棕黃层。

2．吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加1～2倍量含5IU/ml肝素、2%灭活小牛血清的Hanks液（洗涤液），混匀后离心200×g 10分钟，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。

3．再用同样洗涤液洗涤细胞2次，每次离心500×g 10分钟，洗去残留的淋巴细胞分离液。用1%台盼蓝染色检测细胞活力（应>；95%）并计数细胞。再用含10%小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。通常，每毫升外周血可得1×106～2×106PBMC

参与者：zhangwenli

感谢！我照你的方法再试试！

参与者：solarwt

有个好办法，就是用红细胞裂解液裂解掉红细胞，剩下的就全是白细胞了，可以在用淋分液之前用，也可以在用淋分液之后用。

参与者：pwqbq

如果红细胞实在太多，也可在分离前用明胶沉淀大部分红细胞，明胶与全血1：1混匀，室温静止半小时，红细胞会沉降下来，收集上层的细胞悬液，用hank's液洗一遍，再用ficoll常规分离就好了，基本上是没有红细胞了，不过就是多一步，比较麻烦，所以分离外周血时我们是不用的，分离脐带血才用。

参与者：norika

我也做过PBMC的分离，感觉你的问题主要还是出在吸取白色雾状层的时候操作不得要领，吸出来的主要还是杂质细胞。有两个经验之谈：1，如果你是用吸管插到液面里去吸，那你可以选择2ml的吸管或者毛细吸管，在雾状层界面上面一点的地方吸，不能插到细胞层里面去吸；2，还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。我用的第二种方法，比较简单一些，你可以试试看。