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活体RNAi关键点

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1405
 
在活体RNAi关键点:类似药物属性的引入,如稳定性、细胞内的传送、组织的生物可溶性进入合成的siRNA.

授予siRNA类似药物的属性
化学稳定性的胆固醇共聚的siRNA 显著的改善了其在体内和体外的药物属性。
化学稳定性增强的方法:对正义和反义链进行部分的phosporothioate backbone和 2’-O-methyl sugar 修饰,增加其在血清中和组织匀浆中对核酸内切酶和外切酶的抗性。
在反义链的3’ 端引入两个2’-O-methyl核苷酸。
增强其药物属性的方法:在正义链3’ 端通过一个pyrrolidine linker与胆固醇相连接,由于在3’ 端的连接并不改变其siRNA的活性,而且使其能够与HAS特异性的结合(human serum albumin)并且增强了其在血清中的稳定性。
核酸的生物分布:通过对siRNA的RPA分析来确定。
siRNA进入体内的方式:通过尾静脉注射

生物效应的确定:

1.  确定基因是否表达?在何种组织中特异性表达?
2.  试用RT-PCR和Western blot或者免疫组化来确定

siRNA干扰基因表达应该考虑的一些效应:
1.是否是特异性的,而非off-target效应、干扰素效应造成的。
2.siRNA特异性可以用不同的siRNA针对基因不同区域
3.设置阳性对照组,可以设置多个阳性对照组,并且通过GAPDH进行normalization处理
4.设置mismatch对照组

确认siRNA在体内的作用机制
通过5’ RACE来确认特异的mRNA断裂产物,已经在植物和小鼠胚胎中采用方法确定了miRNA指导的mRNA的断裂,此种方法是用来确认是RNAi机制的作用引起目的基因的抑制。

总的来看siRNA干扰都有相应的剂量效应。
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