GFP转染后克隆筛选

问：

我最近对肿瘤细胞转染GFP，其中不含有其他外源性基因。转染后短期内发现阳性细胞非常多，可是随着时间及细胞的增殖，培养孔内的细胞总数在不断的增加，但是发绿色荧光的细胞反而较以前少了（培养液中一直加着G418）。另外，转染后进行有限稀释单克隆的筛选，筛出来的单细胞长成克隆（大约1周）是发光的，但到两周的时候，荧光却消失了。请问这是什么原因？如果我想筛选出整合到宿主细胞染色体中的阳性细胞单克隆，应该怎么筛选？谢谢各位的帮助，并祝新年快乐！！

答：

我觉得这种情况，应该采用逆转录病毒或慢病毒来转染。我也碰到过类似的情况，直接用载体转染筛选，得到的稳定表达只有40-50%的细胞带GFP，而筛选单克隆时，从单克隆细胞得到的细胞群也是相似的情况，大概只有50%左右ＧＦＰ阳性。我个人觉得，质粒直接转染本身整合率就很低，而且整合也不稳定，所以在每一次细胞分裂时就有可能丢失，或产生错误的整合使得GFP基因不完整插入到基因组中。后来，用逆转录病毒感染后，再用G418筛选，就得到100% 的GPF了，因为逆转录病毒带有整合酶和重复长末端序列，这时的整合应该是不是破坏GFP的稳定性。

这仅是我个人的猜测，大家可以就这种情况进行更深入的探讨。