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GFP转染后克隆筛选

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6009

问:

我最近对肿瘤细胞转染GFP,其中不含有其他外源性基因。转染后短期内发现阳性细胞非常多,可是随着时间及细胞的增殖,培养孔内的细胞总数在不断的增加,但是发绿色荧光的细胞反而较以前少了(培养液中一直加着G418)。另外,转染后进行有限稀释单克隆的筛选,筛出来的单细胞长成克隆(大约1周)是发光的,但到两周的时候,荧光却消失了。请问这是什么原因?如果我想筛选出整合到宿主细胞染色体中的阳性细胞单克隆,应该怎么筛选?谢谢各位的帮助,并祝新年快乐!!

答:

我觉得这种情况,应该采用逆转录病毒或慢病毒来转染。我也碰到过类似的情况,直接用载体转染筛选,得到的稳定表达只有40-50%的细胞带GFP,而筛选单克隆时,从单克隆细胞得到的细胞群也是相似的情况,大概只有50%左右GFP阳性。我个人觉得,质粒直接转染本身整合率就很低,而且整合也不稳定,所以在每一次细胞分裂时就有可能丢失,或产生错误的整合使得GFP基因不完整插入到基因组中。后来,用逆转录病毒感染后,再用G418筛选,就得到100% 的GPF了,因为逆转录病毒带有整合酶和重复长末端序列,这时的整合应该是不是破坏GFP的稳定性。

这仅是我个人的猜测,大家可以就这种情况进行更深入的探讨。

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