纯合克隆筛选

纯合克隆筛选

 

1． 融化杂合突变 ES 细胞， ES/LIF 培养液培养，每 2 ～ 3 天传代，实验开始把细胞接种到三个 100mm 铺有凝胶碟皿中，每皿接种 1 ～ 2 × 10⁶ 细胞。为筛选需用一个以上的 ES 杂合突变细胞系，因不同细胞系的转化效率不全相同，另外对检测细胞表型也需如此。

2． 每皿细胞分别加入 1.0 ～ 2.0mg/ml 的 G4178 （终浓度， pH7.4 ）；应用 neo 和 hyg 基因作为筛选标记效果都很好，用 hyg 时浓度为 1.0 ～ 2.0mg/ml 的 hygromycin- β的 ES/LIF 培养液。

3． 培养细胞 7 ～ 10 天，每天换液，仍用含有适当浓度 G418 的 ES/LIF 培养液，培养至出现很多单个克隆为止；如细胞已长满而未出现单个克隆时，应重复 2 ，并加大 G418 浓度。

4． 按前述杂合突变所述 15 ～ 21 步筛选法进行克隆筛选；在出现有杂交片段表示在纯合突变细胞中不存在无改变的靶基因。典型情况下，应有 50 ％为纯合的，这是因为此过程是随机的，个别杂合克隆也可能产生纯合克隆。

5． 进行 Northern 分析 mRNA ，或用免疫吸印分析蛋白质，以确定靶基因是否表达。应是抑活的，即不表达，也不应有正常 mRNA 或蛋白质。