纯合克隆筛选

1．融化杂合突变ES细胞 ，ES/LIF培养液培养，每2～3天传代，实验开始把细胞 接种到三个100mm铺有凝胶碟皿中，每皿接种1～2×10⁶ 细胞 。为筛选需用一个以上的ES杂合突变细胞系，因不同细胞系的转化效率不全相同，另外对检测细胞表型也需如此。

2．每皿细胞分别加入1.0～2.0mg/ml的G418（终浓度，pH7.4）；应用neo和hyg基因作为筛选标记效果都很好，用hyg时浓度为1.0～2.0mg/ml的hygromycin-β的ES/LIF培养液。

3．培养细胞7～10天，每天换液，仍用含有适当浓度G418的ES/LIF培养液，培养至出现很多单个克隆为止；如细胞已长满而未出现单个克隆 时，应重复2，并加大G418浓度。

4．按前述杂合突变所述15～21步筛选法进行克隆筛选；在出现有杂交片段表示在纯合突变细胞中不存在无改变的靶基因。典型情况下，应有50％为纯合的，这是因为此过程是随机的，个别杂合克隆也可能产生纯合克隆 。

5．进行Northern分析mRNA，或用免疫吸印分析蛋白质，以确定靶基因是否表达。应是抑活的，即不表达，也不应有正常mRNA或蛋白质。