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成功进行双酶切实验之实战手册

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如何保证2天获得正确的克隆?

基本操作步骤:
Day 1:
· A: PCR-->电泳回收-->酶切(1-2小时)--> PCR快纯试剂盒回收;
· B: 载体DNA的酶切(1-2小时)--?如有需要,进行电泳回收。
· 注:A和B可同步进行节省时间,然后进行连接(设置载体自连对照),室温0.5-1小时,转化。

Day 2:
· 观察过夜培养的平板上的克隆数:当目的连接板上的克隆数较较对照连接平板上的克隆数多3倍以上时,
· 可以直接随机挑选2-3个克隆进行测序分析。
· 注:基本不用进行菌落PCR验证,一般阳性率在80%以上

常见问题:
在第二天,很多人都发现目的连接和对照连接的克隆数差不多一样,
即使用菌落PCR, 也很难挑选到阳性克隆,只好重做。
运气不好时,可能需要2周,甚至一个月才能得到正确的克隆。

如何避免上述问题?
把握好保证克隆顺利的2点关键:
克隆的关键在于载体DNA和PCR产物的酶切,尤其是载体的完全酶切是克隆的关键。
但在实际的克隆工作中,对以下两点的把握是成败的关键:

· 载体DNA的质量
· PCR产物的完全酶切

1. 保证完全酶切:
· 记住,当你设计一个酶切时,你的限制性内切酶的用量是与DNA分子的大小,以及DNA量是密切相关的。
而且根据每种酶的单位定义,所需的限制性内切酶的量是可以精确计算的。

因而请不要简单的套用酶说明书中的“通用酶切方案“,那个通用酶切方案是很多克隆失败 的原因。

- 在实际工作中,完全酶切同一种DNA分子,不同的酶所需的酶量可能相差20倍之多(详细例子请参考double digestion designer软件中DDDcase部分)。
- 双酶切时,过多的酶量也通常会导致酶出现星活性等问题。
因而,在酶切时,知道每种酶的具体用量是保证完全酶切的关键。DDDesigner的一个主要功能就是根据不同限制性内切酶的单位定义,以及你底物DNA分子的大小以及DNA的量(ug数)来精确计算出完全酶切你的DNA底物所需要的酶量, 为完全酶切提供夯实保证。

2. 确保质粒DNA的质量以及限制性内切酶的活性也是影响克隆成败的关键因素:
1)如果限制性内切酶因为保管不当,导致酶失活或部分失活,那么依据DDDesigner计算出来的酶量就不能保证完全酶切。
2)如果制备的质粒DNA的质量不好(如细菌培养时间过长,质粒制备时裂解不充分或裂解时间过长等),那么对这种质粒DNA进行酶切时,即使酶活性正常,酶量足够,也不能实现完全酶切,因为其中很多质粒DNA已经变性,不能被切开。

下面是一个简单的实验设计,可以用于分析各种可能的问题。

如:拟用NEB的EcoRI+HindIII对质粒DNA进行双酶切,以便进行某基因的克隆。
那么,我们建议,同时设计并进行三种酶切反应:
A: EcoRI+HindIII 双酶切
B: EcoRI单酶切
C: HindIII单酶切

在酶切时,ABC三种酶切反应都用相同的buffer系统,相同的DNA量(建议至少0.5ug), 所需的酶量用DDDesigner进行计算。在合适的温度(37度)酶切1-2个小时, 然后进行电泳分析。电泳分析时,添加两种对照:D:未酶切的质粒DNA和分子量标准(Marker)。

根据电泳的结果,就可以知道酶切是否完全:

如果一切正常,完全酶切后电泳的条带分布如下,

I: 单酶切(B和C)应该只有一条线性化的DNA条带,其大小与质粒的理论长度一致;

II: 未进行酶切的质粒DNA应该主要是一条超螺旋条带,其电泳位置应该在单酶切 产生的线性DNA分子的前面。(有的质粒会在超螺旋条带的后面出现线性化条带和环状DNA条带);

III:双酶切的条带应该只有一条带,而且大小与单切的位置一样 (注意:只有当两个酶切位点间没有大片段插入时,才如此。事实上,大部分质粒的多克隆位点都是如此)。

如果出现以下情况,就表明有问题,

1. 单酶切后(B和/或C),与未酶切的DNA样品(D)的电泳位置一样(即依然为超螺旋)

2. 出现线性化质粒及超螺旋质粒两条带。

这意味着:EcoRI和/或HindIII未能进行完全酶切,原因可能是酶部分失活,或者质粒的质量有问题。 此时,即使双酶切只出现一条线性化DNA条带,也可能在线性化质粒中存在大量的单 酶切的载体。

用此种载体进行克隆,则在连接时出现大量的单酶切载体的自连(载体自连的效率较双片段连接高10倍以上),导致大量的自连克隆,很难挑选到有插入的克隆(克隆失败)。

如果出现此种现象,建议不要盲目进行后续的回收,连接及转化。应该首先逐一查找可能的原因, 如重新制备质粒DNA,或者用其他含有该酶切位点的质粒验证酶的活性等。

只有当上述两种可能的问题都解决了,才能保证完全酶切,进而获得正确的克隆。

以上是分子克隆的常规经验总结,当然还是会有特例比较难做,因为其中涉及到酶量计算,Buffer选择,反应体积,反应条件等多种条件摸索。

一个经典案例分享:用EcoRI+XbaI在质粒上克隆外源基因,但酶切验证时发现在质粒上有两个EcoRI位点,所以不得不进行部分酶切。

这时实验设计可以这样设计:先用XbaI进行完全酶切,然后加少量EcoRI,进行部分酶切,然后回收, 只在一个希望的EcoRI位点切开的条带进行克隆。

这个实验具有一定的复杂性:因为EcoRI 活性非常高,按照常规,即使只酶切5分钟,质粒上的两个EcoRI都全切开了,无法按照设计进行部分酶切。

要解决这个问题,我们要先分析原因:EcoRI 活性虽然高,但在一个反应体系中起决定性的是酶的浓度,所以调整酶量和浓度是反应成功与否的关键。

我们最后成功的实验步骤:

1. 对DNA进行定量。

2. 用Double digest designer(一款在线酶量计算软件)进行酶量计算。

3. 使用理论用量减少1/2,将酶切时间缩短到5分钟。

4. 加SDS终止反应

5. 电泳 + 回收 + 克隆 + 测序验证

最终我们没有放弃EcoRI位点,运用先进的实验信息化工具,成功回收到预期的目的条带,在短短的3天内,完成了复杂的部分酶切实验,得到了理想的阳性克隆。

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