成功进行双酶切实验之实战手册
金弗康
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如何保证2天获得正确的克隆？
基本操作步骤:Day 1：
· A: PCR-->电泳回收-->酶切（1-2小时）--> PCR快纯试剂盒回收；
· B: 载体DNA的酶切（1-2小时）--?如有需要，进行电泳回收。
· 注：A和B可同步进行节省时间，然后进行连接（设置载体自连对照），室温0.5-1小时，转化。
Day 2:
· 观察过夜培养的平板上的克隆数：当目的连接板上的克隆数较较对照连接平板上的克隆数多3倍以上时，
· 可以直接随机挑选2-3个克隆进行测序分析。
· 注：基本不用进行菌落PCR验证，一般阳性率在80%以上
Day 2:
· 观察过夜培养的平板上的克隆数：当目的连接板上的克隆数较较对照连接平板上的克隆数多3倍以上时，
· 可以直接随机挑选2-3个克隆进行测序分析。
· 注：基本不用进行菌落PCR验证，一般阳性率在80%以上
常见问题：
在第二天，很多人都发现目的连接和对照连接的克隆数差不多一样，
即使用菌落PCR， 也很难挑选到阳性克隆，只好重做。
运气不好时，可能需要2周，甚至一个月才能得到正确的克隆。
如何避免上述问题？
把握好保证克隆顺利的2点关键:
克隆的关键在于载体DNA和PCR产物的酶切，尤其是载体的完全酶切是克隆的关键。
但在实际的克隆工作中，对以下两点的把握是成败的关键：
· 载体DNA的质量
· PCR产物的完全酶切
最终我们没有放弃EcoRI位点，运用先进的实验信息化工具，成功回收到预期的目的条带，在短短的3天内，完成了复杂的部分酶切实验，得到了理想的阳性克隆。
在第二天，很多人都发现目的连接和对照连接的克隆数差不多一样，
即使用菌落PCR， 也很难挑选到阳性克隆，只好重做。
运气不好时，可能需要2周，甚至一个月才能得到正确的克隆。
如何避免上述问题？
把握好保证克隆顺利的2点关键:
克隆的关键在于载体DNA和PCR产物的酶切，尤其是载体的完全酶切是克隆的关键。
但在实际的克隆工作中，对以下两点的把握是成败的关键：
· 载体DNA的质量
· PCR产物的完全酶切
1. 保证完全酶切:
· 记住,当你设计一个酶切时，你的限制性内切酶的用量是与DNA分子的大小，以及DNA量是密切相关的。
而且根据每种酶的单位定义，所需的限制性内切酶的量是可以精确计算的。
因而请不要简单的套用酶说明书中的“通用酶切方案“，那个通用酶切方案是很多克隆失败 的原因。
- 在实际工作中，完全酶切同一种DNA分子，不同的酶所需的酶量可能相差20倍之多（详细例子请参考double digestion designer软件中DDDcase部分）。
- 双酶切时，过多的酶量也通常会导致酶出现星活性等问题。
因而，在酶切时，知道每种酶的具体用量是保证完全酶切的关键。DDDesigner的一个主要功能就是根据不同限制性内切酶的单位定义，以及你底物DNA分子的大小以及DNA的量（ug数）来精确计算出完全酶切你的DNA底物所需要的酶量， 为完全酶切提供夯实保证。
2. 确保质粒DNA的质量以及限制性内切酶的活性也是影响克隆成败的关键因素：
1）如果限制性内切酶因为保管不当，导致酶失活或部分失活，那么依据DDDesigner计算出来的酶量就不能保证完全酶切。
2）如果制备的质粒DNA的质量不好（如细菌培养时间过长，质粒制备时裂解不充分或裂解时间过长等），那么对这种质粒DNA进行酶切时，即使酶活性正常，酶量足够，也不能实现完全酶切，因为其中很多质粒DNA已经变性，不能被切开。
下面是一个简单的实验设计，可以用于分析各种可能的问题。
如:拟用NEB的EcoRI+HindIII对质粒DNA进行双酶切，以便进行某基因的克隆。
那么，我们建议，同时设计并进行三种酶切反应：
A: EcoRI+HindIII 双酶切
B: EcoRI单酶切
C: HindIII单酶切
在酶切时，ABC三种酶切反应都用相同的buffer系统，相同的DNA量（建议至少0.5ug）， 所需的酶量用DDDesigner进行计算。在合适的温度（37度）酶切1-2个小时， 然后进行电泳分析。电泳分析时，添加两种对照：D:未酶切的质粒DNA和分子量标准（Marker）。
根据电泳的结果，就可以知道酶切是否完全：
如果一切正常，完全酶切后电泳的条带分布如下，
如果出现以下情况，就表明有问题，
这意味着：EcoRI和/或HindIII未能进行完全酶切，原因可能是酶部分失活，或者质粒的质量有问题。 此时，即使双酶切只出现一条线性化DNA条带，也可能在线性化质粒中存在大量的单 酶切的载体。
用此种载体进行克隆，则在连接时出现大量的单酶切载体的自连（载体自连的效率较双片段连接高10倍以上），导致大量的自连克隆，很难挑选到有插入的克隆（克隆失败）。
如果出现此种现象，建议不要盲目进行后续的回收，连接及转化。应该首先逐一查找可能的原因， 如重新制备质粒DNA，或者用其他含有该酶切位点的质粒验证酶的活性等。
只有当上述两种可能的问题都解决了，才能保证完全酶切，进而获得正确的克隆。
以上是分子克隆的常规经验总结，当然还是会有特例比较难做，因为其中涉及到酶量计算，Buffer选择，反应体积，反应条件等多种条件摸索。
· 记住,当你设计一个酶切时，你的限制性内切酶的用量是与DNA分子的大小，以及DNA量是密切相关的。
而且根据每种酶的单位定义，所需的限制性内切酶的量是可以精确计算的。
因而请不要简单的套用酶说明书中的“通用酶切方案“，那个通用酶切方案是很多克隆失败 的原因。
- 在实际工作中，完全酶切同一种DNA分子，不同的酶所需的酶量可能相差20倍之多（详细例子请参考double digestion designer软件中DDDcase部分）。
- 双酶切时，过多的酶量也通常会导致酶出现星活性等问题。
因而，在酶切时，知道每种酶的具体用量是保证完全酶切的关键。DDDesigner的一个主要功能就是根据不同限制性内切酶的单位定义，以及你底物DNA分子的大小以及DNA的量（ug数）来精确计算出完全酶切你的DNA底物所需要的酶量， 为完全酶切提供夯实保证。
2. 确保质粒DNA的质量以及限制性内切酶的活性也是影响克隆成败的关键因素：
1）如果限制性内切酶因为保管不当，导致酶失活或部分失活，那么依据DDDesigner计算出来的酶量就不能保证完全酶切。
2）如果制备的质粒DNA的质量不好（如细菌培养时间过长，质粒制备时裂解不充分或裂解时间过长等），那么对这种质粒DNA进行酶切时，即使酶活性正常，酶量足够，也不能实现完全酶切，因为其中很多质粒DNA已经变性，不能被切开。
下面是一个简单的实验设计，可以用于分析各种可能的问题。
如:拟用NEB的EcoRI+HindIII对质粒DNA进行双酶切，以便进行某基因的克隆。
那么，我们建议，同时设计并进行三种酶切反应：
A: EcoRI+HindIII 双酶切
B: EcoRI单酶切
C: HindIII单酶切
在酶切时，ABC三种酶切反应都用相同的buffer系统，相同的DNA量（建议至少0.5ug）， 所需的酶量用DDDesigner进行计算。在合适的温度（37度）酶切1-2个小时， 然后进行电泳分析。电泳分析时，添加两种对照：D:未酶切的质粒DNA和分子量标准（Marker）。
根据电泳的结果，就可以知道酶切是否完全：
如果一切正常，完全酶切后电泳的条带分布如下，
I: 单酶切（B和C）应该只有一条线性化的DNA条带，其大小与质粒的理论长度一致；
II： 未进行酶切的质粒DNA应该主要是一条超螺旋条带，其电泳位置应该在单酶切 产生的线性DNA分子的前面。（有的质粒会在超螺旋条带的后面出现线性化条带和环状DNA条带）；
III：双酶切的条带应该只有一条带，而且大小与单切的位置一样 （注意：只有当两个酶切位点间没有大片段插入时，才如此。事实上，大部分质粒的多克隆位点都是如此）。如果出现以下情况，就表明有问题，
1. 单酶切后（B和/或C），与未酶切的DNA样品(D)的电泳位置一样（即依然为超螺旋）
2. 出现线性化质粒及超螺旋质粒两条带。这意味着：EcoRI和/或HindIII未能进行完全酶切，原因可能是酶部分失活，或者质粒的质量有问题。 此时，即使双酶切只出现一条线性化DNA条带，也可能在线性化质粒中存在大量的单 酶切的载体。
用此种载体进行克隆，则在连接时出现大量的单酶切载体的自连（载体自连的效率较双片段连接高10倍以上），导致大量的自连克隆，很难挑选到有插入的克隆（克隆失败）。
如果出现此种现象，建议不要盲目进行后续的回收，连接及转化。应该首先逐一查找可能的原因， 如重新制备质粒DNA，或者用其他含有该酶切位点的质粒验证酶的活性等。
只有当上述两种可能的问题都解决了，才能保证完全酶切，进而获得正确的克隆。
以上是分子克隆的常规经验总结，当然还是会有特例比较难做，因为其中涉及到酶量计算，Buffer选择，反应体积，反应条件等多种条件摸索。
一个经典案例分享：用EcoRI+XbaI在质粒上克隆外源基因，但酶切验证时发现在质粒上有两个EcoRI位点，所以不得不进行部分酶切。
这时实验设计可以这样设计：先用XbaI进行完全酶切，然后加少量EcoRI，进行部分酶切，然后回收， 只在一个希望的EcoRI位点切开的条带进行克隆。
这个实验具有一定的复杂性：因为EcoRI 活性非常高，按照常规，即使只酶切5分钟，质粒上的两个EcoRI都全切开了，无法按照设计进行部分酶切。
要解决这个问题，我们要先分析原因：EcoRI 活性虽然高，但在一个反应体系中起决定性的是酶的浓度，所以调整酶量和浓度是反应成功与否的关键。我们最后成功的实验步骤：
1. 对DNA进行定量。
2. 用Double digest designer（一款在线酶量计算软件）进行酶量计算。
3. 使用理论用量减少１／２，将酶切时间缩短到５分钟。
4. 加SDS终止反应
5. 电泳 + 回收 + 克隆 + 测序验证最终我们没有放弃EcoRI位点，运用先进的实验信息化工具，成功回收到预期的目的条带，在短短的3天内，完成了复杂的部分酶切实验，得到了理想的阳性克隆。
