免疫荧光技术之荧光显微镜检查方法

1、荧光显微镜

2、荧光显微镜标本制作要求

（1）载玻片

载玻片厚度应在0.8~1.2 mm之间，太厚的玻片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚焦。载玻片必须光亮清洁，厚度均匀，无明显自发荧光，有时需用石英玻璃载玻片。

（2）盖玻片

盖玻片厚度在0.17 mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质（如氟化镁）的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光又可激发标本。

（3）标本

组织切片或其它标本不能太厚，若太厚，激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发。另外，细胞重叠或杂质掩盖，背景非特异染色引起的荧光影响结果判断。

（4）封裱剂

封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5~9.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5 mol/L pH9.0~9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。如果用抗褪色剂封裱荧光染色标本更有利于显微摄影。配方是将P-次苯基二胺二氢氯100 mg加入PBS10 m中，调pH至9.0~9.5，再加入甘油90 ml，混匀，在室温放置过夜，待其中小气泡完全消失即可使用。

（5）镜油

一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，可用甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。对于落射光荧光显微镜BX60，Nikon E-1000无须镜油。