荧光显微镜观察法

1. 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

2. 细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色体浓缩、DNA降解、凋亡小体的形成等。在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine,PS）位于细胞膜内侧，但在凋亡细胞中，PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中，Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca²⁺的依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-V进行荧光素（如FITC 、PE）或生物素（biotin）标记，以标记了的膜联蛋白-V作为探针，利用荧光显微镜检测细胞凋亡的发生。

1. 收集约10⁶细胞，用冷PBS洗2次。

2. 4%福尔马林4℃固定10min左右后涂片，晾干。

3. 以5-10μg/mL hocchst 33258染色5-10min，水冲净，晾干后观察，以紫外光（340nm）激发hocchest。

2. 反应完毕后尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。

荧光显微镜与其他显微镜的区别：

1、光源：普通显微镜采用的是普通的自然光，而它采用的是波长短，分辨率高的紫外线。

2、照明方式：荧光显微镜采用的是较为特殊的落射式，将光源直接投射在样品上。

3、滤光片：为了保护观察者的眼睛，荧光显微镜在目镜和物镜之间安装了可以过滤掉伤眼的紫外线的滤光片。

使用荧光显微镜时：

1、要严格遵照说明书的指示操作，不能跨步或随意调换更改顺序。

2、观察时要在黑暗的空间中进行。等到眼睛适应黑暗环境后，再进行观察。

3、为了避免紫外线对眼睛的伤害，调节光源时需要带上防护眼镜。

4、由于光源是有一定使用寿命的，所以一切步骤都需要节约时间，从而保护光源，让它的使用寿命最长化。