核酸凝胶电泳观察法

相关专题

 

【1】DNA琼脂 糖凝胶电泳
实验原理：琼脂糖是海藻中提取的线状高聚物，不同浓度的琼脂糖密度不同，一般PCR产物使用2％浓度，0.5Kb-10Kb的DNA使用1％浓度，基因组 DNA使用0.3%-0.7%浓度；不同大小的核酸在同一浓度的凝胶中迁移率不同，因为分子越大其受琼脂糖的阻力越大，迁移率与碱基对的对数值成反比；同分子量不同构象的核酸迁移率也不同，超螺旋环状DNA迁移率〉线状DNA迁移率〉带切口环状DNA迁移率。
荧光染料溴化乙锭可嵌入DNA堆积碱基间，DNA吸收的254nm的紫外辐射与溴化乙锭在302nm和366nm处的光吸收可在590nm处(可见光红橙区)发光，利于观察，用于核酸凝胶鉴定。

一、实验材料：琼脂糖、溴化乙锭(10mg/ml)、6×loading buffer、凝胶电泳缓冲液(1×TAE或0.5×TBE)、电泳仪 、电泳槽、微波炉
50×TAE(储存液)： 242g/L Tris碱
57.1ml/L 冰乙酸
100ml/L 0.5M EDTA (PH 8.0)
6×loading buffer：0.25% 溴酚兰
0.25% 二甲苯青FF
15%聚蔗糖(Ficoll 400型) (pharmacia)
琼脂糖 (promega)

二、实验方法：
1．配置凝胶电泳缓冲液，用相应的凝胶电泳缓冲液配置相应浓度的凝胶。
2．微波炉加热使凝胶融化，温度降至60℃左右加入溴化乙锭 (终浓度为0.5ug/ml)混匀。
3．将胶倒入槽中至厚度约3-5mm左右，梳子距槽底1-2mm，并去除气泡。
4．倒入凝胶电泳缓冲液，小心拔去梳子。
5．DNA样品与6×loading buffer混匀加入凝胶加样孔中，接上电源，电压降采用1－5V/cm，DNA由负极向正极移动。
6．电泳一般30分钟足矣，可根据溴酚兰和二甲苯青FF的位置延长电泳时间，电泳完毕，UV下观察。
三、注 意
1．溴化乙锭是强诱变剂兼有中毒毒性，使用时必须戴手套。
2．不同的DNA样品需不同的电泳方案，需参见文献。本文为一般常用法。

四、参考文献：
J．萨姆布鲁克． 1995， 分子克隆，P308－313。