流式细胞仪检测健康儿童T淋巴细胞亚群及其绝对计数的研究

T淋巴细胞亚群与机体的免疫功能相关，当免疫功能紊乱时，T淋巴细胞亚群在相对百分含量及绝对计数的数值检测上会出现异常。因此，T淋巴细胞亚群的检测对监控疾病的发生发展、了解疾病的机制、指导临床治疗都有及其重要的意义。以往文献以报道成年人淋巴细胞亚群计数研究较多，相关儿童的淋巴细胞亚群计数研究报道较少。本文采用流式细胞术方法，建立健康儿童T淋巴细胞亚群的百分含量及绝对计数分析正常参考值，希冀对临床诊疗有所帮助，现报告如下。

1、资料与方法

1.1 一般资料 本组50例健康儿童外周血标本均来自我院体检者，男28例，女22例，年龄7个月～18周岁。

1.2 试剂 CD4FITC/CD8PE/CD3PeCy5、CD45APC及溶血素购自美国Coulter-Immunotech公司，TruCount 管购自美国BD公司。

1.3 仪器 FACS Vantage流式细胞仪（美国BD公司）。

1.4 方法
　　1.4.1 样品制备 50μl全血反相抽吸入TruCount管，加20μl荧光抗体，室温避光孵育20min；50μl溶血素及500μl蒸馏水分别与标本孵育各10min，待检。

　　1.4.2 流式分析 FACS Vantage流式细胞仪，配置氩离子激光器及氦-氖激光器，激发波长分别为488nm和633nm。采用CellQuestPro软件分析T淋巴细胞群体百分含量及细胞绝对计数，收集测定细胞10000个。

　　1.4.3 统计学方法 采用均数±标准差（x±s），方差分析。

2、结果

健康儿童T淋巴细胞（CD3+细胞群体）占淋巴群体的百分率为65.16±7.05%，绝对计数为2029.75±718.85个/μl全血，辅助性T淋巴细胞（CD3+、CD4+细胞群体）占淋巴群体的百分率为38.61±6.15%，绝对计数为1226.00±482.44个/μl全血，抑制性T淋巴细胞（CD3+、CD8+细胞群体）占淋巴群体的百分率为23.38±7.31%，绝对计数为639.30±270.77个/μl全血，CD4/CD8比值为1.86±0.80。

3、讨论

儿童由于其机体发育未完全成熟，与成年人相比，其免疫系统各淋巴细胞群体在相对及绝对数值上都存在着一定的差异，因此临床儿科领域需要有不同于成年人的淋巴细胞群体的相对及绝对的正常参考值。

T淋巴细胞，即CD3阳性细胞群体，介导机体的细胞免疫，可用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。其数值的升高或降低均显示其机体的免疫系统的异常。T淋巴细胞的辅助/诱导细胞亚群，即CD3、CD4双阳性细胞群体，其主要功能是辅助诱导其他免疫细胞，通过分泌的淋巴因子，增强和扩大免疫应答，CD4细胞的减少，必导致免疫功能低下；CD4细胞的过高，可导致免疫功能的亢进。T淋巴细胞的抑制/细胞毒细胞亚群，即CD3、CD8双阳性细胞群体，可特异性杀伤靶细胞，具有抗病毒、抗肿瘤及重要的调节作用。CD4⁺/CD8⁺的比值是重要的免疫状态监测指标，用于评价那些自身免疫失调或已知患有免疫缺陷的患者的免疫状态，其比例的降低与免疫系统损害的程度相关。

本文采用流式细胞术进行T淋巴细胞亚群的相对及绝对计数检测，其在方法学上具有无可比拟的优越性。首先，在仪器的使用上，流式细胞仪是对流动的悬浮在液体中的分散细胞进行的自动化检测，它集激光、物体流变学、细胞化学、计算机检测技术为一体，凭借其快速、精确，短时间内可测数千至上万个细胞，并对各个细胞进行多参数定量分析的优势特点，已在各学科领域受到越来越多的重视；其次，在试剂的选择上，本文采取的是四色荧光标记技术，通过CD3、CD4、CD8、CD45这4种荧光标记抗体，极大限度的精确了淋巴细胞群体及其各亚群。通过流式细胞仪的前向散射信号（FSC）及侧向散射信号（SSC）图谱，可粗步圈出淋巴细胞群体，再通过CD45，这一白细胞的共同抗原，可进一步精确淋巴细胞群体的定位，极大降低了操作者在分析流式数据时存在的主观影响因素，进一步精确各亚群的计数。最后，在绝对计数这一环节，本文采用的是美国BD公司的专利技术-绝对计数管（TruCount tube），利用其管内的已知数量的微球（beads），再加上精确的全血反向加样技术，最终计算出各细胞亚群的绝对含量，这一技术与通过公式（白细胞计数×各群体相对百分含量）计算出的绝对数相比，其精确性是不言而喻的。

本文利用流式细胞术进行健康儿童的T淋巴细胞亚群的相对及绝对计数检测，从结果来看，与文献报道基本一致，Denney和Kotylo报道的儿童淋巴细胞亚群正常参考值与年龄相关，不同年龄段的儿童，其正常值也不同，本实验室也正进行这方面资料的积累。因此，临床儿科领域应有一套与儿童相关的正常参考值范围，这是毋庸置疑的。希望本文的检测技术与数据结果对临床有所帮助。